哺乳動物獲能精子蛋白酪氨酸磷酸化研究進(jìn)展

胡啟蒙，何 群，何建云，李蒙玉，楊宇新

(廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北省動物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 廊坊 065000)

人類和動物不育癥是世界性問題，其原因復(fù)雜，其中雄性不育所引起的約占40%[1]。傳統(tǒng)方法檢測或預(yù)測精卵受精功能已不能滿足現(xiàn)階段的研究需求，需要更加精準(zhǔn)的檢測，深入分子層面了解精子獲能及受精作用的機(jī)制，為解決哺乳動物不孕不育作出判斷。

精子是一種高度分化的生殖細(xì)胞，其功能發(fā)揮是通過多種信號通路調(diào)節(jié)完成的，信號通路的主要調(diào)控方式之一就是酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)[2]。精子蛋白通過酪氨酸磷酸化轉(zhuǎn)錄后修飾，保證精子受精完成的相關(guān)生理活動順利進(jìn)行，其中包括精子活力、超激活運(yùn)動(化學(xué)趨向性)、獲能、頂體反應(yīng)以及精子和透明帶結(jié)合，這些功能都受到蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的精準(zhǔn)調(diào)控，保證精子功能的正常發(fā)揮[3]。精子蛋白酪氨酸磷酸化過程受體內(nèi)和體外多種因素的影響，如精子所在內(nèi)環(huán)境的pH、體外環(huán)境等。

1 精子獲能

1951年是精子生物學(xué)領(lǐng)域關(guān)鍵的一年，Austin(1951)和Change(1951)通過獨(dú)立研究大鼠(Rat)[4]和兔(Rabbit)[5]發(fā)現(xiàn)，排卵期懸浮于輸卵管中的精子無受精能力，但是如果存在于排卵期前幾小時(shí)的輸卵管中的精子則具有受精能力。后又進(jìn)一步研究了精子受精的生理機(jī)制，1952年Austin首次使用了“capacitation”，譯為“獲能”來描述精子需要經(jīng)歷具有時(shí)間依賴性的生理變化從而獲得受精能力。獲能過程具有物種特異性，有的物種完成獲能所用時(shí)間短，有的物種則耗時(shí)長。精子獲能過程中頭部發(fā)生頂體反應(yīng)，精子質(zhì)膜與卵子的透明帶相融合，此時(shí)精子尾部具有超激活運(yùn)動的能力，可穿越雌性生殖道輸卵管，穿透卵子透明帶[6]。

從精子獲能的發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)歷60年的時(shí)間，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)激發(fā)和支持精子獲能所必需的成分，其中包括HCO3-、Ca2+以及血清白蛋白等[7]，通過體外培養(yǎng)，獲得具有受精能力的精子。將體外獲能培養(yǎng)的精子作為研究對象，可進(jìn)一步了解精子受精能力的分子機(jī)理。

2 酪氨酸磷酸化與精子獲能

磷酸化是一種常見的翻譯后修飾作用，通過添加或去除酪氨酸、蘇氨酸或絲氨酸基團(tuán)，引起蛋白的活化或失活[3]。磷酸化不僅存在于真核細(xì)胞內(nèi)，也適用于原核細(xì)胞及細(xì)菌[8]。蛋白磷酸化可引起其結(jié)構(gòu)的變化，在細(xì)胞各功能中起極其重要的作用，如細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞凋亡及離子瞬間調(diào)控等。蛋白質(zhì)磷酸化在精子生理中也具有極其重要意義。

2.1 酪氨酸磷酸化與精子活力

精子向卵子有方向性的運(yùn)動能力被稱為精子活力。精子活力是保證精卵受精成功的條件之一。精子運(yùn)動能力弱或不動的精子都不具備正常的生理功能。超激活運(yùn)動是一種劇烈的精子運(yùn)動模式，通過大幅度增加精子鞭毛不對稱擺動，從而提供精子穿越卵子透明帶順利與卵子結(jié)合的動力。超激活運(yùn)動被視為精子獲能標(biāo)志，精子發(fā)生獲能過程極為復(fù)雜，獲能生理過程的調(diào)控信號通路，幾乎都涉及到蛋白酪氨酸磷酸化。Yanagimachi[9]研究發(fā)現(xiàn)附睪中的精子不能發(fā)生受精反應(yīng)，原因是其相關(guān)蛋白還未完成酪氨酸磷酸化反應(yīng)。精子在附睪中成熟后，通過射精作用，進(jìn)入雌性生殖道內(nèi)，受精作用前，精子的相關(guān)蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化調(diào)控獲能信號通路，完成獲能反應(yīng)，從而獲得受精能力，順利完成與卵子的結(jié)合。Visconti及其同事[10-11]研究證實(shí)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化過程與獲能和頂體反應(yīng)密切相關(guān)；有研究人員也發(fā)現(xiàn)了酪氨酸磷酸化與精卵結(jié)合的關(guān)系。通過研究精子酪氨酸磷酸化反應(yīng)，了解精子受精能力的分子機(jī)制[12]。

目前有20多種蛋白與精子鞭毛纖維有關(guān)，人精子中存在有A型激酶錨定蛋白(A-kinase-anchoring proteins,AKAPs)和鈣結(jié)合酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)蛋白(Calcium-bingeing tyrosine phosphorylation-regulated protein,CABYR)，這些蛋白結(jié)合于精子鞭毛主段的纖維鞘上，可影響精子運(yùn)動，此過程由蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)調(diào)控[12]，PKA抑制劑可有效的阻止精子發(fā)生超激活運(yùn)動[13]。

肌動蛋白聚合是精子獲能過程中重要的環(huán)節(jié)，對精子運(yùn)動有促進(jìn)作用。它是一個(gè)時(shí)間依賴性過程，從尾部開始，沿續(xù)至頭部。肌動蛋白聚合對精子運(yùn)動有促進(jìn)作用，肌動蛋白解體對頂體反應(yīng)有促進(jìn)作用。肌動蛋白的聚合由酪氨酸磷酸化控制，當(dāng)酪氨酸磷酸化過程被抑制，肌動蛋白的聚合作用也被抑制，從而獲能反應(yīng)受到影響[14]。

2.2 酪氨酸磷酸化與頂體反應(yīng)

只有發(fā)生了獲能反應(yīng)的精子才能激發(fā)頂體反應(yīng)，頂體反應(yīng)可以保證精子與卵子順利結(jié)合[15]。與頂體反應(yīng)有關(guān)的蛋白酪氨酸磷酸化種類已有研究，小鼠精子中Acrosin binding protein位于頂體上，獲能期間發(fā)生酪氨酸磷酸化，參與精子頂體反應(yīng)和透明帶融合[16]。

3 酪氨酸磷酸化與精子能量代謝

能量代謝是支持精子功能的重要條件。哺乳動物精子細(xì)胞內(nèi)能量的來源是ATP，ATP為精子運(yùn)動、蛋白質(zhì)調(diào)控以及受精作用提供能量。精子相對于體細(xì)胞需要更多的ATP，不只是維持精子的運(yùn)動，還因?yàn)樾枰{(diào)控獲能期間蛋白質(zhì)磷酸化[17]。獲能精子磷酸戊糖途徑有兩種關(guān)鍵酶，一種是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)和6-磷酸葡萄糖磷酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGD)，在體外培養(yǎng)環(huán)境中，提高cAMP的存在量以及蛋白酪氨酸磷酸化程度增加，均使這兩種酶活性提高。

糖酵解或氧化磷酸化過程是ATP的直接來源，這兩個(gè)途徑雖獨(dú)立存在發(fā)揮作用，但也相互協(xié)調(diào)共同為精子提供所需要的能量[18]。根據(jù)不同的物種特異性，精子獲取能量所依賴這兩種途徑的程度有所不同。

4 酪氨酸磷酸化信號通路

目前已知的調(diào)控精子蛋白酪氨酸磷酸化的通路是cAMP-PKA信號通路。細(xì)胞內(nèi)的cAMP濃度由腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclases，ACs)控制，哺乳動物體內(nèi)含有兩種類型的ACs，一種是tmACs(transmembrane AC enzymes)，另一種為sAC(soluble AC)?？扇苄韵佘账岘h(huán)化酶可直接被HCO3-調(diào)控，精子獲能期間，質(zhì)膜發(fā)生膽固醇外流，HCO3-和Ca2+通過膜上離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)激活sAC，sAC水解ATP生成cAMP，cAMP可作為第二信使激活PKA[19]。試驗(yàn)還證實(shí)其他信號通路如磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)信號通路[20]、分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路[21]和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)信號通路等可間接調(diào)控精子蛋白酪氨酸磷酸化水平[22]。

5 酪氨酸磷酸化影響因素

5.1 體內(nèi)因素

5.1.1 Ca2+鈣離子對精子蛋白磷酸化具有重要的調(diào)控作用，是精子功能完成的重要保證[23]。試驗(yàn)證明精子細(xì)胞中Ca2+在調(diào)節(jié)精子運(yùn)動和蛋白質(zhì)磷酸化方面具有雙重功能。低濃度鈣離子可以促進(jìn)精子運(yùn)動和蛋白磷酸化程度，但鈣離子濃度較高時(shí)則會抑制精子運(yùn)動能力[23]。鈣離子通過調(diào)節(jié)cAMP和ATP的含量來調(diào)節(jié)精子運(yùn)動和蛋白磷酸化程度。其信號通路包括cAMP/PKA和Ca2+/CaM/CaMK[23]。

5.1.2 pH、HCO3-和BSA 獲能后精子才具有受精能力，獲能是受精的關(guān)鍵，Ca2+、HCO3-和BSA是精子體外獲能培養(yǎng)液的主要成分，是探究精子獲能的重點(diǎn)，也是調(diào)控酪氨酸磷酸化的重要影響因素[24]。精子獲能所依賴的一系列分子事件與雌性生殖道內(nèi)環(huán)境有關(guān)。研究表明，雌性生殖道含有高濃度的HCO3-，其對精子運(yùn)動、精子獲能、超激活運(yùn)動以及頂體反應(yīng)起重要的調(diào)節(jié)作用。HCO3-是細(xì)胞內(nèi)的主要緩沖離子。在獲能過程中能通過非pH依賴性的方式直接刺激sAC，另外，其作用受PKA的調(diào)控，HCO3-濃度升高后，激活sAC，從而改變cAMP的濃度，而sAC是精子蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸磷酸化必需的[13]。BSA可通過調(diào)節(jié)精子質(zhì)膜上的Ca2+通道，誘發(fā)細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活cAMP/PKA依賴性信號系統(tǒng)并促進(jìn)蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化，最終使精子獲能[25]。

5.1.3 ROS 人類不育是影響人類健康的一個(gè)重大問題，男性不育病因復(fù)雜，其臨床表現(xiàn)為低精、絕精或精子無生理功能。不能生成正常功能精子的原因可能是精索靜脈曲張、隱睪癥、營養(yǎng)不良、感染或創(chuàng)傷，也可能是生活環(huán)境污染、化學(xué)治療、吸煙或疾病。值得注意的是，所有上述條件的氧化應(yīng)激是作為其病理生理機(jī)制的重要組成部分[26]。

體內(nèi)的活化氧ROS氧化應(yīng)激反應(yīng)是由于生理過程中產(chǎn)生活性氧或者是抗氧化能力減弱(或兩者均存在)[26]，其作用于所有細(xì)胞成分。體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)對精子獲能以及精子蛋白酪氨酸磷酸化作用是雙重的。低濃度ROS觸發(fā)獲能事件，如活化腺苷酸活化酶、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和磷酸化過程，最終蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸磷酸化。當(dāng)精子所處環(huán)境氧化應(yīng)激反應(yīng)過強(qiáng)時(shí)，精膜抗氧化酶水平低，精子的運(yùn)動能力減弱、線粒體的活性降低[27]，甚至造成DNA破碎。其中30%～80%男性不育的原因是由于活性氧引起的精子損傷[28]。在體外獲能培養(yǎng)精子條件下，添加活性氧成分，精子酪氨酸磷酸化程度以及頂體反應(yīng)與未獲能精子相似[29]。

5.2 外界作用

5.2.1 細(xì)菌污染 研究報(bào)道細(xì)菌會影響豬精子質(zhì)量，例如獲能的指標(biāo)(精子活力下降，質(zhì)膜的排列紊亂，精子存活率降低以及磷酸化程度變化)下降。當(dāng)豬精子中綠膿桿菌的濃度高于106CFU/mL時(shí)，可顯著影響精子脂膜重新排列的程度，從而造成精卵融合速度降低，精子運(yùn)動能力減弱，呈現(xiàn)較為典型的“似獲能”狀態(tài)，磷酸化程度也受到相應(yīng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，豬精液存在大腸桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、綠膿桿菌[30]。人工精子采集過程中，無法達(dá)到無菌狀態(tài)，精液會受到細(xì)菌的侵染。正常射精過程中，精液中也會存在一系列的微生物，嚴(yán)重的情況下會影響精子功能和質(zhì)量，從而導(dǎo)致不育。

5.2.2 其他 BisphenolA (BPA) 是一種廣泛存在于環(huán)境中的污染物，會影響人類及其他哺乳動物。其主要來源于食物包裝、工業(yè)原料、牙齒填充物等。BPA具有毒性以及環(huán)境殘留強(qiáng)的特性，目前受到公眾健康研究的重視。BPA作為激素?cái)_亂劑，可抑制雄性激素、甲狀腺激素生成。BPA暴露的方式主要是人類及動物攝取受到BPA污染的食物，同時(shí)還可通過真皮吸收和呼吸途徑作用[31]。

氟化鈉是一種環(huán)境污染物，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下發(fā)現(xiàn)其對動物具有雄性不育作用。近40多年，越來越多環(huán)境污染物中含有氟，其中氟化鈉的存在對于臨床和實(shí)驗(yàn)動物具有生理毒性，抑制細(xì)胞內(nèi)ATP和Ca2+的含量，對PKA活性也有影響，從而造成蛋白酪氨酸磷酸化的降低，影響正常雄性生殖功能[32]。

大黃素是中國傳統(tǒng)中藥成分，對小鼠精子功能具有一定影響，可抑制鈣離子的生成，降低蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化[33]。

環(huán)境毒物鉻(Cr，六價(jià))減少精子活力，降低蛋白酪氨酸磷酸化程度。高濃度的Cr降低體外培養(yǎng)的豬精子活力。Cr影響線粒體活性，減少ATP的產(chǎn)生，從而降低精子中段蛋白酪氨酸磷酸化的含量。Cr通過cAMP/PKA通路影響活力和蛋白酪氨酸磷酸化[34]。

6 展 望

哺乳動物精子是一種高度分化的特異性生殖細(xì)胞，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)等科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，精子生理學(xué)得到了發(fā)展，特別是獲能精子生理研究進(jìn)入新階段。在臨床治療男性不育方面，通過阻斷獲能過程中關(guān)鍵酶控，阻止精子受精所研制出的男性避孕藥，減少意外懷孕風(fēng)險(xiǎn), 增加女性健康關(guān)愛的力度。在經(jīng)濟(jì)型家畜生產(chǎn)中，針對解凍后精子受精能力下降，找到合適的外界培養(yǎng)條件，減少低溫及氧化對精子的刺激，提高解凍后精子的受精能力。

但獲能精子蛋白酪氨酸磷酸化調(diào)控信號通路以及與代謝途徑的關(guān)系還未完全了解，其中酪氨酸磷酸化蛋白在獲能期間具體功能還需要后續(xù)研究。(1)深入研究哺乳動物獲能精子中酪氨酸磷酸化蛋白在能量代謝途徑中的具體功能，可以進(jìn)一步了解氧化磷酸化途徑和糖酵解途徑在精子獲能中的作用。(2)精子蛋白酪氨酸磷酸化具有時(shí)間依賴性，可動態(tài)研究獲能精子酪氨酸磷酸化過程。(3)借助基因剔除動物的輔助實(shí)驗(yàn)，了解復(fù)雜的酪氨酸磷酸化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，感謝實(shí)驗(yàn)動物對科學(xué)所作出的貢獻(xiàn)。