抗阻運(yùn)動(dòng)通過(guò)刺激骨骼肌FSTL1分泌抑制心梗大鼠心肌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制探討

郝美麗，席 悅，田振軍*

（1.陜西師范大學(xué) 體育學(xué)院 暨運(yùn)動(dòng)生物學(xué)研究所 運(yùn)動(dòng)與心血管健康研究室，陜西 西安710119；2.洛陽(yáng)師范學(xué)院 體育學(xué)院，河南 洛陽(yáng)471934）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）導(dǎo)致心肌缺血缺氧產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，心肌細(xì)胞發(fā)生壞死或凋亡，心功能顯著下降（Bao et al.，2018；Ma et al.，2018），最終導(dǎo)致心力衰竭（Yang et al.，2019）。因此，減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌纖維化，改善MI 后心功能至關(guān)重要。

卵泡抑素樣蛋白1（Follistatin-like protein 1，F(xiàn)STL1）屬于分泌型糖蛋白，可由骨骼肌和心肌產(chǎn)生并分泌（Oshima et al.，2008；Ouchi et al.，2008）。增 加MI 小鼠心外膜FSTL1 表達(dá)，可顯著降低心肌纖維化水平（Wei et al.，2015）。心臟缺血/再灌注（ischemia/ reperfusion，I/R）小鼠靜脈注射rhFSTL1 蛋白，可顯著降低心肌細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，減少心肌梗死面積（Ogura et al.，2012）。小鼠經(jīng)醛固酮誘導(dǎo)心衰后，給予靜脈注射rhFSTL1 腺病毒載體可顯著降低病理性心肌肥大，相反，特異性敲除心肌fstl1后心臟的心肌肥大顯著增加（Tanaka et al.，2016）。表明，F(xiàn)STL1 在病理性心臟保護(hù)中發(fā)揮重要作用。

運(yùn)動(dòng)鍛煉是心血管疾病預(yù)防和康復(fù)的安全有效手段之一，適宜的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可改善氧化應(yīng)激，降低MI 心臟的炎癥反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌的血管生成（Bei et al.，2017；Lu et al.，2015；Rodrigues et al.，2014），改善MI 心臟的左室病理性重構(gòu)（Haykowsky et al.，2011），提高M(jìn)I 患者的生存率（Jorge et al.，2011）?？棺柽\(yùn)動(dòng)可降低心衰大鼠或病人心臟的膠原沉積和炎癥反應(yīng)，改善骨骼肌和心臟的功能（Alves et al.，2014；Toth et al.，2012），是MI 后安全有效的康復(fù)方式之一。骨骼肌目前被視為分泌樣器官，可合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，并通過(guò)旁分泌和內(nèi)分泌方式對(duì)周邊及遠(yuǎn)隔器官發(fā)揮生物學(xué)作用（Pedersen et al.，2012）。文獻(xiàn)表明，運(yùn)動(dòng)可刺激骨骼肌細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放（Peake et al.，2015）。但關(guān)于抗阻運(yùn)動(dòng)是否通過(guò)刺激骨骼肌源性FSTL1 分泌，提高M(jìn)I 大鼠心肌FSTL1 表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究，尚缺少文獻(xiàn)報(bào)道。本文擬采用心梗大鼠抗阻運(yùn)動(dòng)或脛骨前肌注射FSTL1 腺相關(guān)病毒載體干預(yù)，LPS 干預(yù)構(gòu)建H9C2 細(xì)胞凋亡模型，rhFSTL1、AMPK 激動(dòng)劑AICAR 和PI3K 抑制劑LY294002 干預(yù)H9C2 心肌細(xì)胞，對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探討，為MI 心臟的運(yùn)動(dòng)康復(fù)手段和靶點(diǎn)篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：ALC-V8 小動(dòng)物呼吸機(jī)、Power-Lab/8ST 生物信號(hào)采集系統(tǒng)、ZH-PT 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)、勻漿機(jī)、蛋白定量?jī)x、Bio-Rad 水平電泳儀和轉(zhuǎn)移槽、凝膠成像系統(tǒng)、BMII 型病理組織包埋機(jī)、LEICA-RM2126 切片機(jī)、YT-6C 生物組織攤烤片機(jī)、Olympus BX51 光學(xué)顯微鏡、Nikon Eclipse 55i 熒光顯微鏡等。

主要試劑：兔多克隆抗體FSTL1（Proteintech 公司），DIP2A（Biorbyt 公司），山羊抗兔二抗（西安晶彩），p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR（美國(guó)Cell Signaling Technology），小鼠單克隆抗體Bcl2、Bax、兔多克隆抗體cTnT（北京博奧森），F(xiàn)ITC 標(biāo)記的山羊抗兔二抗、TUNEL 試劑盒（碧云天），BCA 蛋白定量試劑盒（西安晶彩），LPS、rhFSTL1、AMPK 激動(dòng)劑AICAR、PI3K 抑制劑LY294002（selleck）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和MI模型制備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：雄性SD 大鼠60 只，購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心，動(dòng)物編號(hào)：SCXK（陜）2012-003，體重180-220 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎手術(shù)制備MI 模型。術(shù)后存活40 只，隨機(jī)分為心梗安靜對(duì)照組（MI）、心梗+抗阻運(yùn)動(dòng)組（MR）、心梗+腺相關(guān)病毒空載體組（MV）、心梗+FSTL1 腺相關(guān)病毒載體組（MF），每組10 只。另選取10 只，只穿線不結(jié)扎，作為假手術(shù)組（S）。所有大鼠自由飲食飲水，室溫21℃～28℃，濕度50%～60%。

MI 模型制備：大鼠稱重后，腹腔注射5%戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg），麻醉后，大鼠仰臥固定，小動(dòng)物呼吸機(jī)呼吸面罩輔助呼吸，全程連接心電進(jìn)行監(jiān)測(cè)。開胸，暴露心臟，于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐交界點(diǎn)下2 mm 處進(jìn)針結(jié)扎，以心電圖ST 段抬高或T 波倒置，結(jié)扎處下方心肌顏色變淺或變白為造模成功的標(biāo)志，造模成功后逐層縫合，排氣關(guān)胸。

1.3 抗阻運(yùn)動(dòng)方案和腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建及注射方案

抗阻運(yùn)動(dòng)方案：依據(jù)參考文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定抗阻運(yùn)動(dòng)方案（Alves et al.，2012；Grans et al.，2014）。術(shù)后1周，MR 組開始進(jìn)行爬梯運(yùn)動(dòng)，爬梯高1.1 m，間隔2 cm，傾斜角度85°。第1 周為無(wú)負(fù)重適應(yīng)性抗阻運(yùn)動(dòng)，第2～4 周為負(fù)荷遞增的抗阻運(yùn)動(dòng)，每天遞增負(fù)荷為體重的10%，當(dāng)負(fù)荷達(dá)到75% 體重后，保持該負(fù)荷直到訓(xùn)練結(jié)束，5 天/周×4 周。

腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建及注射方案：委托賽業(yè)公司采用AAV8 構(gòu)建骨骼肌特異性高表達(dá)fstl1載體dMCK- Prom-Hfstl1-3xflag-IRES-EGFP，以無(wú)Hfstl1 序列的AAV8 載體作為空載體對(duì)照。腺相關(guān)病毒載體注射方案：依據(jù)參考文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定注射方案（Arruda et al.，2003；Tanaka et al.，2016）。術(shù)后1周，MF組于左后肢脛骨前肌注射FSTL1 腺相關(guān)病毒載體，MV 組在相同部位注射腺相關(guān)病毒空載體，注射量均為1×1010PFU。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及激動(dòng)劑、重組蛋白和抑制劑干預(yù)方案

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：H9C2 細(xì)胞分為8 組，即H9C2 空白對(duì)照組、H9C2+LPS 組、H9C2+LPS+LY294002 組、H9C2+LPS+rhFSTL1+AICAR 組、H9C2+LPS+rhFSTL1 組、H9C2+LPS+rhFSTL1+LY294002 組、H9C2+LPS+AICAR 組 和H9C2+LPS+AICAR+LY294002 組。除H9C2 空白對(duì)照組外，其余各組經(jīng)LPS、激動(dòng)劑、重組蛋白和抑制劑干預(yù)刺激。

LPS、激動(dòng)劑、重組蛋白和抑制劑干預(yù)方案：10%FBS完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)H9C2 心肌細(xì)胞，隔天換液。細(xì)胞傳代貼壁后，用10 μM 濃度的PI3K 抑制劑LY294002 進(jìn)行干預(yù)，然后更換培養(yǎng)基為2%FBS 完全培養(yǎng)基，再用100 ng/ml濃度的rhFSTL1 蛋白和1 mM 濃度的AMPK 激動(dòng)劑AICAR 干預(yù)48 h，10 μg/ml 濃度的LPS 干預(yù)4 h，提取蛋白和固定細(xì)胞。

1.5 大鼠心功能檢測(cè)

4 周訓(xùn)練結(jié)束后次日，稱重，腹腔麻醉，分離右頸總動(dòng)脈，將導(dǎo)管從右頸總動(dòng)脈逆行送入至左心室。生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張壓（left ventricular end- diastolic pressure，LVEDP）和左室壓力最大升/降速率（±dp/dtmax）等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，評(píng)定心功能。

1.6 Masson染色

經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后立即摘取心臟和左后肢脛骨前肌，用于組織學(xué)和分子相關(guān)實(shí)驗(yàn)。心臟經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h 后，流水沖洗，梯度酒精脫水，三氯甲烷透明，石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片并制片。常規(guī)Masson 染色。光鏡下觀察拍片，Image-ProPlus 5.1 軟件分析測(cè)定心肌膠原面積百分比（CVF%）。

1.7 Western Blotting實(shí)驗(yàn)

取MI 大鼠邊緣區(qū)心肌組織和左后肢脛骨前肌50 mg左右，加入蛋白提取試劑，低溫下勻漿，離心并取上清，進(jìn)行蛋白定量，血清直接進(jìn)行蛋白定量；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)各組將干預(yù)刺激后的6 孔板從培養(yǎng)箱中取出，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗2 次，每 孔 加 入100 μl 的RIPA 裂解液、PMSF 和磷酸酶抑制劑各1 μl，刮取細(xì)胞移入EP 管中超聲破碎，低溫離心，取上清，進(jìn)行蛋白定量。

常規(guī)Western Blotting 實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)STL1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、Bcl2 和Bax 稀釋濃度均為1：1 000、DIP2A 稀釋 濃度為1：200，GAPDH 稀釋濃度為1：8 000。ECL 發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.8 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

TRIzol 提取心梗邊緣區(qū)心肌組織總RNA，用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參照TaKaRa PCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Real Time PCR。引物序列：fstl1-F：5'-GCCTCTCTCTCCTCCTCTCTCT-3'；fstl1-R：5'-GCATAGGGTTTGTTGGTTT-3'；gapdh-F：5'- CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT -3'；gapdh-R：5'-AGGGGCC ATCCACAGTCTTC-3'（上海生工）。采用比較Ct 法（2-△△Ct）進(jìn)行mRNA 定量統(tǒng)計(jì)。

1.9 TUNEL檢測(cè)

切片脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，BSA 封閉，滴加兔多克隆抗體cTnT（1：100），4℃過(guò)夜。次日，蛋白酶K（去DNase，20 μg/ml）37℃孵育，TUNEL 檢測(cè)液和FITC 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1：100）和DAPI（1：800）混合抗體37℃避光孵育，熒光顯微鏡下觀察拍片。

4%的多聚甲醛固定H9C2 細(xì)胞30 min 后，取細(xì)胞懸液15 ul 滴于載玻片上，貼片干燥，PBS 洗滌5 min/次×1 次，加入含0.3%Triton X-100 的PBS，室溫孵育5 min，避光滴加TUNEL 檢測(cè)液（TdT 酶：熒光標(biāo)記液=1：9），37℃避光孵育1 h，PBS 洗滌3 min/次×2 次，熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍片。

1.10 CCK8檢測(cè)

將H9C2 細(xì)胞懸液配制成5 000 個(gè)/100 μl，取100 μl/孔接種于96 孔板，細(xì)胞貼壁后在96 孔板內(nèi)加入相應(yīng)激動(dòng)劑、重組蛋白、抑制劑和LPS 干預(yù)。每孔加入10 μl CCK8溶液，放回培養(yǎng)箱，孵育1 h 后，酶標(biāo)儀檢測(cè)，測(cè)定450 nm吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.11 數(shù)據(jù)處理

Western Blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Image Lab 5.2 進(jìn)行處理分析，顯微鏡圖像用Image-Pro Plus 5.1 軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和相關(guān)分析，GraphPad Prism 5.0 軟件作圖，組間差異顯著性水平選擇P＜0.05 或P＜0.01。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 骨骼肌FSTL1在抗阻運(yùn)動(dòng)保護(hù)MI大鼠心臟中發(fā)揮重要作用

2.1.1 抗阻運(yùn)動(dòng)顯著升高M(jìn)I 大鼠骨骼肌、血清和心肌FSTL1蛋白水平

Western Blotting 和RT-qPCR 結(jié)果顯示，骨骼肌中，與S組比較，MI 組FSTL1 基因表達(dá)下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；與MI 組比較，MR 組FSTL1 基因和蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）（圖1A、B）。心肌中，與S 組比較，MI 組FSTL1 基因表達(dá)增加但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與MI 組比較，MR 組FSTL1 基因表達(dá)稍有減少但無(wú)顯著性差異，蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）（圖1C、D）。血清中，與S 組比較，MI 組FSTL1蛋白水平顯著增加（P＜0.01）；與MI 組比較，MR 組FSTL1蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖1E）。表明，抗阻運(yùn)動(dòng)顯著升高M(jìn)I 大鼠骨骼肌、血清、心肌FSTL1 蛋白水平，顯著增加骨骼肌FSTL1 基因表達(dá)，但對(duì)心肌FSTL1 基因表達(dá)無(wú)顯著影響。

相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清FSTL1 蛋白濃度與骨骼肌和心肌FSTL1 蛋白表達(dá)均呈顯著正相關(guān)（r=0.863，P＜0.01；r=0.875，P＜0.01）；骨骼肌FSTL1 與心肌FSTL1 蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.857，P＜0.01）（圖1F-H）。表明，心肌FSTL1 蛋白表達(dá)和血清FSTL1 含量隨骨骼肌FSTL1 蛋白表達(dá)的增加而增加。提示，抗阻運(yùn)動(dòng)上調(diào)MI 大鼠心肌FSTL1 蛋白表達(dá)，可能是骨骼肌FSTL1 蛋白通過(guò)循環(huán)到達(dá)心臟。

2.1.2 骨骼肌高表達(dá)fstl1可升高M(jìn)I 大鼠骨骼肌和心肌FSTL1蛋白表達(dá)和血清FSTL1水平

Western Blotting 結(jié)果顯示，與MV 組比較，MF 組的骨骼肌和心肌FSTL1 蛋白表達(dá)和血清FSTL1 含量均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）（圖2A-C）。表明，骨骼肌FSTL1 可通過(guò)循環(huán)到達(dá)MI 大鼠心臟。

2.1.3 抗阻運(yùn)動(dòng)或骨骼肌高表達(dá)fstl1抑制MI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡

TUNEL 檢測(cè)結(jié)果顯 示，與S 組比較，MI 組TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加（P＜0.01）；與MI 組比較，MR 組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著減少（P＜0.05）；與MV 組比較，MF 組TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞顯著下降（P＜0.05）。相關(guān)分析結(jié)果顯示，MI 后大鼠心肌FSTL1 蛋白表達(dá)與心肌凋亡數(shù)目呈顯著負(fù)相關(guān)（r= -0.634，P＜0.01）（圖3A-B）。

Western Blotting 結(jié)果顯示，與S組比較，MI組Bcl2/Bax 比值顯著降低（P＜0.01）；與MI 組比較，MR 組Bcl2/Bax 比值顯著升高（P＜0.05）；與MV 組比較，MF 組Bcl2/Bax 比值顯著增加（P＜0.01）（圖3C）。

圖1 抗阻運(yùn)動(dòng)顯著升高M(jìn)I大鼠骨骼肌、血清和心肌FSTL1蛋白水平且三者顯著正相關(guān)Figure 1.Resistance Exercise Significantly Increased the Protein Level of FSTL1 in MI Rats’Skeletal Muscle，Serum and Myocardium and a Positive Correlation was Observed between Them

圖2 骨骼肌高表達(dá)fstl1顯著升高M(jìn)I大鼠骨骼肌和心肌FSTL1蛋白表達(dá)及血清FSTL1水平Figure 2. fstl1 Overexpression in Skeletal Muscle Significantly Increased the Protein Level of FSTL1 in MI Rats’Skeletal Muscle，Serum and Myocardium

表明，MI 后心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，抗阻運(yùn)動(dòng)或骨骼肌高表達(dá)fstl1可顯著抑制MI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

2.1.4 抗阻運(yùn)動(dòng)或骨骼肌高表達(dá)fstl1激活MI 心肌Akt/mTOR信號(hào)通路

Western Blotting 結(jié)果顯示，與S 組比較，DIP2A、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 比值MI 組均升高（P＜0.01，p-Akt/Akt無(wú)顯著性差異）；與MI 組比較，MR 組均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）；與MV 組比較，MF 組均顯著升高（P＜0.01）（圖4A-C）。表明，MI 后抗阻運(yùn)動(dòng)或骨骼肌高表達(dá)fstl1可激活A(yù)kt/mTOR 信號(hào)通路。

2.1.5 抗阻運(yùn)動(dòng)或骨骼肌高表達(dá)fstl1降低MI 大鼠心肌纖維化并改善心功能

Masson 染色結(jié)果顯示，光鏡下，心肌細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，心肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。與S 組比較，MI組膠原纖維過(guò)度增生，CVF %顯著增加（P＜0.01）；與MI組比較，MR 組心肌組織纖維化有所減少，CVF %顯著降低（P＜0.05）；與MV 組比較，MF 組纖維化水平下降，CVF%顯著下降（P＜0.05）（圖5A-B）。相關(guān)分析結(jié)果顯示，MI 后大鼠心肌FSTL1 蛋白表達(dá)與CVF%呈顯著負(fù)相關(guān)（r= -0.759，P＜0.01）。表明，MI 后膠原纖維過(guò)度增生，抗阻運(yùn)動(dòng)或骨骼肌高表達(dá)fstl1均可抑制膠原纖維進(jìn)一步擴(kuò)大，減小MI 心肌纖維化擴(kuò)散面積。

心功能檢測(cè)結(jié)果顯示，與S 組比較，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax指標(biāo)MI 組均顯著降低（P＜0.01），LVEDP 顯著升高（P＜0.01）；與MI 組比較，MR 組均顯著上升（P＜0.01，P＜0.05），LVEDP 顯著下降（P＜0.05）；與MV 組比較，MF組均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），LVEDP 顯著降低（P＜0.01）（圖5C-F）。表明，抗阻運(yùn)動(dòng)或骨骼肌高表達(dá)fstl1均可顯著改善MI 大鼠心功能。

2.2 FSTL1在抗阻運(yùn)動(dòng)抑制MI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討

2.2.1 AICAR可促進(jìn)H9C2細(xì)胞FSTL1及其受體的表達(dá)

H9C2細(xì)胞的Western Blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS 干預(yù)后FSTL1 及其受體DIP2A 表達(dá)顯著下降（P＜0.01）；與LPS 干 預(yù) 比 較，LPS+AICAR、LPS+rhFSTL1 和LPS+AICAR+rhFSTL1 干 預(yù)后FSTL1 及其受體DIP2A 表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）（圖6A-B）。表明，AICAR 促進(jìn)H9C2 細(xì)胞FSTL1 及其受體表達(dá)。

2.2.2 rhFSTL1 可激活A(yù)kt-mTOR 信號(hào)通路，抑制LPS 誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡

H9C2 細(xì)胞的TUNEL 和CCK8 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS 干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），存活率顯著減少（P＜0.01）；與LPS 組比較，LPS+rhFSTL1 干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.01），存活率顯著增加（P＜0.01），LPS+LY294002 干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），存活率顯著降低（P＜0.05）；與LPS+rhFSTL1 組比較，LPS+rhFSTL1+LY294002 干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），存活率顯著下降（P＜0.01）；與LPS+LY294002組比較，LPS+rhFSTL1+LY294002 干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.01），存活率顯著增加（P＜0.05）（圖7A-C）。

PI3K 抑制劑LY294002 可有效抑制Akt 的磷酸化水平，H9C2 細(xì) 胞Western Blotting 結(jié)果顯示，p-Akt/Akt、pmTOR/mTOR、Bcl2/Bax 比值，與對(duì)照組比較，LPS 干預(yù)后顯著下降（P＜0.01）；與LPS 組比較，LPS+rhFSTL1 干預(yù)后顯著增加（P＜0.01），LPS+LY294002 干預(yù)后p-Akt/Akt 比值顯著下降（P＜0.01）；與LPS+rhFSTL1 組比較，LPS+rhFSTL1+LY294002 干預(yù)后顯著下降（P＜0.01）；與LPS+LY2-94002 組比較，LPS+rhFSTL1+LY294002 干預(yù)后顯著增加（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）（圖7D-F）。表明，rhFSTL1激活A(yù)kt/mTOR 信號(hào)通路，抑制LPS 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡，增加H9C2 細(xì)胞存活率。

2.2.3 AICAR 激活A(yù)kt-mTOR 信號(hào)通路，抑制LPS 誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡

圖3 抗阻運(yùn)動(dòng)或骨骼肌高表達(dá)fstl1顯著抑制MI大鼠心肌細(xì)胞凋亡Figure 3.Resistance Exercise or fstl1 Overexpression in Skeletal Muscle Significantly Inhibited Cardiomyocyte Apoptosis in MI Rats

圖4 抗阻運(yùn)動(dòng)或骨骼肌高表達(dá)fstl1激活MI心肌Akt/mTOR信號(hào)通路Figure 4.Resistance Exercise or fstl1 Overexpression in Skeletal Muscle Significantly Activated Akt/mTOR Signaling Pathway in MI Rats’Heart

圖5 抗阻運(yùn)動(dòng)或骨骼肌高表達(dá)fstl1抑制MI心臟纖維化且改善心功能Figure 5.Resistance Exercise or fstl1 Overexpression in Skeletal Muscle Reduced Myocardium Fibrosisand Improved Heart Function in MI Rats

圖6 H9C2細(xì)胞FSTLI及其受體DIP2A蛋白表達(dá)結(jié)果Figure 6.The Protein Expression of FSTL1 and its Receptor of DIP2A in H9C2 Cells

H9C2 細(xì)胞TUNEL 和CCK8 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS 干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），存活率顯著減少（P＜0.01）；與LPS 組比較，LPS+AICAR 干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.01），存活率顯著增加（P＜0.01），LPS+LY294002 干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），存活率顯著降低（P＜0.05）；與LPS+AICAR 組比較，LPS+AICAR+LY294002 干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），存活率顯著下降（P＜0.05）；與LPS+LY294002組比較，LPS+AICAR+LY294002 干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.01），存活率顯著增加（P＜0.05）（圖8A-C）。

圖7 rhFSTL1激活A(yù)kt-mTOR信號(hào)通路，抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡Figure 7.rhFSTL1 Activated the Akt/mTOR Signaling Pathway and Inhibited LPS-induced H9C2 Cells Apoptosis

H9C2 細(xì) 胞Western Blotting 結(jié)果顯示，p-Akt/Akt、pmTOR/mTOR、Bcl2/Bax 比值，與對(duì)照組比較，LPS 干預(yù)后顯著下降（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）；與LPS 組比較，LPS+AICAR干預(yù)后顯著增加（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01），LPS+LY294002 干預(yù)后p-Akt/Akt 比值顯著下降（P＜0.05）；與LPS+AICAR 組比較，LPS+AICAR+LY294002干預(yù)后顯著下降（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）；與LPS+LY294002 組比 較，LPS+AICAR+LY294002 干 預(yù)后 顯 著增加（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）（圖8D-F）。表明，AICAR激活A(yù)kt/mTOR 信號(hào)通路，抑制LPS 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡，增加H9C2 細(xì)胞存活率。

3 分析與討論

適宜運(yùn)動(dòng)可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有利影響已得到證實(shí)。文獻(xiàn)表明，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可顯著抑制MI 大鼠心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)心肌血管再生，改善心功能，提高運(yùn)動(dòng)能力（Lu et al.，2015；Shen et al.，2017）；游泳運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)I/R 小鼠心肌細(xì)胞增殖（Bei et al.，2017），抑制I/R 大鼠心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能（Zhang et al.，2007）；抗阻運(yùn)動(dòng)可顯著提高M(jìn)I 大鼠最大攝氧量，減少心肌膠原蛋白沉積，改善左室心功能（Alves et al.，2017；Cai et al.，2018；Hentschke et al.，2017），增加中老年冠狀動(dòng)脈疾病患者的活動(dòng)能力和肌肉力量（Yamamoto et al.，2016）。另有文獻(xiàn)報(bào)道，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)、機(jī)械振動(dòng)、抗阻運(yùn)動(dòng)均可增加MI 大鼠心肌FSTL1 表達(dá)，促進(jìn)心肌血管再生，降低心肌纖維化，改善心功能，其中，抗阻運(yùn)動(dòng)的效果較為顯著（席悅 等，2016）。表明，運(yùn)動(dòng)在病理性心臟改善過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且抗阻運(yùn)動(dòng)的作用更為顯著。此外，抗阻運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌也可產(chǎn)生影響。研究報(bào)道，抗阻運(yùn)動(dòng)可抑制肌肉抑制素的表達(dá)，抑制蛋白質(zhì)降解，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)骨骼肌肥大，提高新陳代謝水平（Damas et al.，2015；Schwarz et al.，2016）?？棺柽\(yùn)動(dòng)或有氧運(yùn)動(dòng)等可刺激骨骼肌產(chǎn)生分泌多種細(xì)胞因子或肌肉因子（myokines），且可到達(dá)肝臟、骨骼、脂肪組織和免疫系統(tǒng)等發(fā)揮作用（Ost et al.，2016；Pedersen et al.，2012）。另有文獻(xiàn)報(bào)道，橫紋肌產(chǎn)生的肌肉因子可釋放進(jìn)入血液對(duì)遠(yuǎn)隔器官發(fā)揮作用（Stránská et al.，2015）。因此認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)上調(diào)骨骼肌細(xì)胞因子的表達(dá)且可通過(guò)內(nèi)分泌方式與其他組織或器官進(jìn)行交叉對(duì)話。據(jù)此推測(cè)，抗阻運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)骨骼肌肌肉因子的表達(dá)與分泌，且可通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)心臟發(fā)揮作用。

圖8 AICAR激活A(yù)kt-mTOR信號(hào)通路，抑制LPS誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡Figure 8.AICAR Activated the Akt/mTOR Signaling Pathway and Inhibited LPS-induced H9C2 Cells Apoptosis

研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌注射FGF21 腺病毒載體或注射LIF載體對(duì)MI 小鼠心臟具有保護(hù)效應(yīng)（Arruda et al.，2003；Joki et al.，2015），但有關(guān)骨骼肌高表達(dá)fstl1是否可對(duì)MI心臟產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)鮮有報(bào)道。文獻(xiàn)表明，11 周的力量訓(xùn)練后骨骼肌中fstl1mRNA 表達(dá)增加（Norheim et al.，2011），1 h 的騎自行車運(yùn)動(dòng)后人類循環(huán)FSTL1 水平上升（G?rgens et al.，2013）。循環(huán)FSTL1 的改變可影響心臟功能和全身物質(zhì)能量代謝過(guò)程（Seki et al.，2018）。左股動(dòng)脈損傷的小鼠，骨骼肌特異性fstl1敲除后，血清中FSTL1蛋白減少52%；骨骼肌特異性fstl1高表達(dá)后，血清中FSTL1 蛋白增加6.9 倍。表明，骨骼肌可能是循環(huán)FSTL1的主要來(lái)源（Miyabe et al.，2014）。推測(cè)，骨骼肌源性FSTL1 可由骨骼肌分泌進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而到達(dá)遠(yuǎn)隔器官或組織發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，抗阻運(yùn)動(dòng)顯著升高心肌、血清和骨骼肌FSTL1 蛋白水平，心肌fstl1mRNA 表達(dá)無(wú)顯著變化，骨骼肌fstl1mRNA 表達(dá)顯著增加，且血清與骨骼肌和心肌FSTL1 蛋白水平均呈顯著正相關(guān)，骨骼肌與心肌FSTL1 蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)。因此認(rèn)為，抗阻運(yùn)動(dòng)或脛骨前肌注射FSTL1 腺相關(guān)病毒載體后骨骼肌產(chǎn)生的FSTL1 經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)心臟。

研究報(bào)道，I/R 小鼠靜脈注射FSTL1 腺病毒載體可使心肌細(xì)胞凋亡減少70.9%，心肌梗死面積減少66.0%（Oshima et al.，2008）。MI 小鼠心外膜FSTL1 表達(dá)增加可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，降低心肌纖維化（Wei et al.，2015）。主動(dòng)脈縮窄（transverse aortic constriction，TAC）小鼠心肌和血清FSTL1 蛋白表達(dá)顯著增加，心肌fstl1特異性敲除后可加劇TAC 導(dǎo)致的心肌肥大和功能紊亂；fstl1轉(zhuǎn)基因小鼠可抑制TAC 導(dǎo)致的心肌肥大和重塑（Shimano et al.，2011）。表明，F(xiàn)STL1 在病理性心臟中具有重要的保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，抗阻運(yùn)動(dòng)或脛骨前肌注射FSTL1腺相關(guān)病毒載體干預(yù)MI 大鼠后，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均顯著升高，LVEDP 和CVF%顯著降低，心肌細(xì)胞凋亡顯著減少。心肌FSTL1 蛋白表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化呈顯著負(fù)相關(guān)。因此認(rèn)為，抗阻運(yùn)動(dòng)或脛骨前肌注射FSTL1 腺相關(guān)病毒載體后骨骼肌源性FSTL1 經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)心臟，抑制心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌纖維化，改善MI 大鼠心功能，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。運(yùn)動(dòng)可刺激骨骼肌細(xì)胞因子的分泌，也可動(dòng)員全身其他器官或組織細(xì)胞因子分泌。關(guān)于抗阻運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌和其他器官或組織分泌FSTL1 經(jīng)血液到達(dá)心臟是否發(fā)揮不同的保護(hù)作用，本研究未進(jìn)行比較。

Akt 是心臟應(yīng)對(duì)外界刺激時(shí)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，PI3K/Akt 信號(hào)通路在心臟的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮十分重要的作用（Shiojima et al.，2006）。研究報(bào)道，PI3K/Akt 信號(hào)通路激活后可改善心臟氧化應(yīng)激水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，降低病理性心肌肥大（Ke et al.，2015；Lin et al.，2015；Sun et al.，2016）。DIP2A 是FSTL1體內(nèi)的細(xì)胞表面受體（Tanaka et al.，2010），F(xiàn)STL1 腺病毒載體分別轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和心室肌細(xì)胞后，小RNA 干擾其受體DIP2A，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和心室肌細(xì)胞Akt 的磷酸化水平顯著降低，凋亡顯著增加（Ouchi et al.，2010）。FSTL1 腺病毒載體轉(zhuǎn)染心室肌細(xì)胞可激活A(yù)kt/mTOR 信號(hào)通路，抑制缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞凋亡；小RNA 介導(dǎo)的常氧和H/R 干預(yù)的心室肌細(xì)胞中FSTL1 沉默，可導(dǎo)致凋亡顯著增加，Akt 的磷酸化水平顯著下降（Oshima et al.，2008）。FSTL1 蛋白可通過(guò)激活A(yù)kt 信號(hào)通路和抑制Smad1/5/9 信號(hào)通路減少H9C2 細(xì)胞凋亡（Chen et al.，2016b）。表明，PI3K/Akt 信號(hào)通路在FSTL1 發(fā)揮心臟保護(hù)的過(guò)程中具有十分重要的作用。研究報(bào)道，Bcl2 和Bax 是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白（Shirali et al.，2013），PI3K/Akt 信號(hào)通路激活后可增加凋亡相關(guān)蛋白Bcl2/Bax 的比值抑制細(xì)胞凋亡（Chen et al.，2016a）。表明，PI3K/Akt 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，抗阻運(yùn)動(dòng)或脛骨前肌注射FSTL1 腺相關(guān)病毒載體后，MI 大鼠心DIP2A 的蛋白表達(dá)及p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 和Bcl2/Bax 的比值均顯著增加。表明，F(xiàn)STL1 可與其受體DIP2A 結(jié)合激活下游Akt/mTOR 信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，抑制心肌細(xì)胞凋亡。運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的積極影響大部分是由AMPK 激活引起的（Grochowska et al.，2014），因此，AMPK 的活化可作為運(yùn)動(dòng)的靶向效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，rhFSTL1 和AICAR 可激活A(yù)kt/mTOR 信號(hào)通路，上調(diào)Bcl2/Bax 比值，抑制LPS 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞存活率。以上結(jié)果共同表明，抗阻運(yùn)動(dòng)或脛骨前肌注射FSTL1 腺相關(guān)病毒載體上調(diào)心肌FSTL1 表達(dá)，心肌FSTL1 與其受體DIP2A 結(jié)合，激活下游PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌纖維化，改善MI大鼠心功能（圖9）。但關(guān)于FSTL1 降低MI 大鼠心肌纖維化的具體信號(hào)機(jī)制本研究未進(jìn)行探討，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將會(huì)進(jìn)一步研究。

圖9 抗阻運(yùn)動(dòng)通過(guò)刺激骨骼肌FSTL1分泌抑制心梗大鼠心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制Figure 9.The Mechanism of Resistance Exercise Inhibits Cardio‐myocyte Apoptosis Through Stimulating the Skeletal Muscle FSTL1 Secretion in MI Rats

4 結(jié)論

在抗阻運(yùn)動(dòng)上調(diào)MI 大鼠心肌FSTL1 表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中，骨骼肌源性FSTL1 發(fā)揮重要作用，骨骼肌源性FSTL1 可通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)心臟，與其受體DIP2A結(jié)合，激活下游Akt-mTOR 信號(hào)通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌纖維化，改善MI 大鼠心功能。