HPLC 法同時(shí)測定結(jié)石通膠囊中夏佛塔苷等成分的含量

王婧寧，姚建華，趙志國，何秀菊

1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 制劑管理部，遼寧沈陽 110032；2 北京弘生醫(yī)藥科技有限公司，北京102600

結(jié)石通膠囊由廣金錢草、雞骨草、車前草、茯苓、石韋等8 味中藥材加工制成，臨床上主要用于泌尿系統(tǒng)感染、膀胱炎、腎炎水腫、尿路結(jié)石、淋瀝渾濁、尿道灼痛等病癥的治療[1]。在結(jié)石通膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道中[2]，僅對方中石韋所含綠原酸進(jìn)行了定量檢測，專屬性不強(qiáng)。

本研究參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，選取結(jié)石通膠囊方中君藥廣金錢草和佐藥雞骨草所含代表性成分夏佛塔苷、異夏佛塔苷；臣藥車前草所含主要活性成分大車前苷、毛蕊花糖苷、木通苯乙醇苷B；佐藥茯苓所含特征成分去氫土莫酸、茯苓酸為定量測定目標(biāo)成分；建立HPLC 法同時(shí)測定結(jié)石通膠囊中7種成分含量，為全面評價(jià)結(jié)石通膠囊質(zhì)量提供參考。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Ulti Mate3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo-Fisher 公司）；AZ210 型電子天平（日本島津公司）。

1.2 藥品與試藥

夏佛塔苷對照品（批號：111912-201703，純度：95.6%）、大車前苷對照品（批號：111914-201604，純度：90.2%）、毛蕊花糖苷對照品（批號：111530-201914，純度：95.2%）、木通苯乙醇苷B 對照品（批號：111910-201604，純度：98.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；異夏佛塔苷對照品（批號：18022831，純度：98.6%）、去氫土莫酸對照品（批號：16111522，純度：98.0%）、茯苓酸對照品（批號：18053121，純度：99.5%）均購于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；結(jié)石通膠囊（每粒0.35 g，批號：J181006、J190403、J190603，江西紅星藥業(yè)有限公司產(chǎn)品）。乙腈為色譜純，其它試劑為分析純；實(shí)驗(yàn)室用水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取夏佛塔苷、異夏佛塔苷、大車前苷、毛蕊花糖苷、木通苯乙醇苷B、去氫土莫酸、茯苓酸對照品各適量，用60%甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0.354、0.402、0.718、0.286、0.172、0.134、0.156 mg·mL-1的7 種對照品貯備液；精密量取7 種對照品貯備液各2.5 mL，置50 mL 量瓶中，用60%甲醇溶液配制成混合對照品溶液（其濃度分別為17.7、20.1、35.9、14.3、8.6、6.7、7.8 μg·mL-1）。

2.1.2 供試品溶液 取結(jié)石通膠囊20 粒，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取1.0 g，精密稱定，加60%甲醇溶液25 mL，密塞，超聲提取30 min，放冷，用60%甲醇溶液補(bǔ)重，配制成結(jié)石通膠囊供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液 按結(jié)石通膠囊處方，分別制備缺車前草、缺茯苓、缺廣金錢草和雞骨草的3 種陰性樣品，再按“2.1.2”方法配制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及專屬性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸溶液，梯度洗脫（梯度洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：272 nm（0～19.0 min 檢測夏佛塔苷和異夏佛塔苷[3]、330 nm（19.0～40.0 min 檢測大車前苷、毛蕊花糖苷和木通苯乙醇苷B[4]）和210 nm（40.0～60.0 min 檢測去氫土莫酸和茯苓酸[5]）；進(jìn)樣量：10 μL。

取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液及“2.1.2～2.1.3”項(xiàng)下各溶液適量，依法進(jìn)樣檢測。結(jié)果表明，結(jié)石通膠囊中上述7 種成分與雜質(zhì)成分能得到很好分離，分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)按所測主成分峰計(jì)均不低于4 500，陰性樣品對測定無干擾，色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下7 種對照品貯備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用60%甲醇溶液配制成6 個(gè)系列濃度的混合對照品溶液，依法進(jìn)樣檢測7 種成分的峰面積，采用質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 結(jié)石通膠囊中7 種成分的回歸方程及線性范圍

2.4 精密度試驗(yàn)

取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得7 種成分峰面積的RSD 分別為0.82%、0.77%、0.53%、0.96%、1.09%、1.21%、1.14%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次結(jié)石通膠囊樣品適量，平行制備6份結(jié)石通膠囊供試品溶液，依法進(jìn)樣測定得7 種成分的含量的RSD 分別為1.40%、0.36%、1.19%、1.51%、0.66%、0.87%、1.73%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取結(jié)石通膠囊樣品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法臨用新配1 份供試品溶液，于制備后0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣檢測各成分的峰面積，結(jié)果表明，結(jié)石通膠囊供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定，7 種成分峰面積的RSD 分別為0.79%、0.74%、0.55%、0.93%、1.07%、1.23%、1.11%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批次（批號：J181006）各已知的結(jié)石通膠囊樣品適量，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，每份0.5 g，共取9份，精密稱定，置25 mL 量瓶中，隨機(jī)分成3 組，分別精密加入混合對照品溶液（夏佛塔苷0.218 mg·mL-1、異夏佛塔苷0.256 mg·mL-1、大車前苷0.464mg·mL-1、毛蕊花糖苷0.192 mg·mL-1、木通苯乙醇苷B 0.108 mg·mL-1、去氫土莫酸0.074 mg·mL-1、茯苓酸0.096 mg·mL-1）0.5 mL 3 份、1.0 mL 3 份、1.5 mL 3份，使其符合《中國藥典》2015 年版四部規(guī)定的要求，對照品加入量約為樣品含有量的50%、100%和150%，再按“2.1.2”項(xiàng)下方法配制成加樣回收供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄待測樣品中7 種成分的測得量，用測得量與樣品含有量之差，除以對照品加入量，計(jì)算回收率。平均加樣回收率、平均RSD（n=9）為：夏佛塔苷98.52%、1.2%；異夏佛塔苷99.07%、0.92%；大車前苷100.12%、0.74%；毛蕊花糖苷98.06%、1.14%；木通苯乙醇苷B 97.16%、1.37%；去氫土莫酸96.99%、1.08%；茯苓酸99.37%、0.80%。

2.8 結(jié)石通膠囊中7 種成分含量測定

取3 個(gè)批次結(jié)石通膠囊樣品各適量，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取1.0 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法每個(gè)批次平行制備3 份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測各成分的峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算7種成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 3 批樣品含量測定結(jié)果（n=3，mg·g-1）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)，考察了不同濃度甲醇溶液[4]（40%、60%、80%[2]、100%）、不同提取方式（超聲提取法[5]、加熱回流提取法）、不同提取時(shí)間（15、30、45 min）下的提取率；結(jié)果顯示60%甲醇綜合提取率最高；加熱回流提取處理后得到的樣品雜質(zhì)明顯增多；提取45 min 的提取率未見增加。故最終確定采用60%甲醇超聲提取30 min，對結(jié)石通膠囊進(jìn)行供試品溶液的制備。

對于流動相的考察[3-5]：對比了甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.2%甲酸溶液流動相系統(tǒng)，對色譜圖基線平穩(wěn)情況、7 種成分色譜峰峰形及分離效果、雜質(zhì)數(shù)量等指標(biāo)的影響，同時(shí)對優(yōu)選的流動相比例進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定采用乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相，按照表1 中流動相比例進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)對結(jié)石通膠囊中7 種成分含量的同時(shí)檢測。