屏南縣羊口瘡病的診斷和PCR流行病學(xué)調(diào)查

陸李枝

摘?要：羊口瘡病是屏南縣羊養(yǎng)殖過程中常見的疾病之一，制約了屏南縣養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。為了確定屏南縣臨床羊口瘡病的病原以及了解該病在屏南縣的流行情況，為該病的科學(xué)防治提供依據(jù)。采用PCR方法檢測(cè)了12份縣域內(nèi)臨床羊口瘡病的病原，并隨機(jī)采集了縣域內(nèi)6家規(guī)模養(yǎng)羊場(chǎng)（戶）217份羊只血樣進(jìn)行羊口瘡病的流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果表明：12份病例的病變組織、血樣提取的病毒基因組DNA樣品均擴(kuò)增出約500 bp片段，與預(yù)期片段大小一致，明確了引起屏南縣臨床羊口瘡病的病原為羊口瘡病毒（ORFV）;屏南縣6家規(guī)模養(yǎng)羊場(chǎng)（戶）的羊口瘡病毒（ORFV）感染率為14.63%～33.33%，平均感染率為25.99%;抽樣調(diào)查的群體中有羊口瘡臨床病癥的羊只均為1～3月齡羔羊，各養(yǎng)殖場(chǎng)臨床發(fā)病率為0～16.33%，平均發(fā)病率為9.69%，低于羊群羊口瘡病毒（ORFV）感染率。

關(guān)鍵詞：羊口瘡;流行病學(xué);PCR診斷;屏南縣

中圖分類號(hào)：S826?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：0253-2301（2020）01-0046-04

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.01.008

Diagnosis and PCR Epidemiological Investigation of Sore Mouth Disease in Pingnan County

LU Li?zhi

（Pingcheng Town Animal Husbandry and Veterinary Station of Pingnan County， Ningde， Fujian 352399， China）

Abstract： The sore mouth disease is one of the common diseases in sheep breeding in Pingnan County， which has restricted the healthy development of sheep breeding industry in Pingnan County. By determining the pathogen of clinical sore mouth disease in Pingnan County and understanding the prevalence of the disease in Pingnan County， it would provide a basis for the scientific prevention and treatment of the disease. PCR was used to detect the pathogens of 12 cases of clinical sore mouth disease in the county， and a total of 217 sheep blood samples were randomly collected from 6 large?scale sheep farms （households） in the county for epidemiological investigation. The results showed that the DNA samples of viral genome extracted from the pathological tissue and blood samples of the 12 cases were amplified to approximately 500 bp fragments， which were consistent with the expected fragment size， so it was identified that the pathogen causing clinical sore mouth disease in Pingnan County was ORFV. The infection rate of ORFV in 6 large?scale sheep farms （households） in Pingnan County was 14.63%-33.33%， with an average infection rate of 25.99%. Among the sampled groups， all the sheep with clinical symptoms of sore mouth disease were 1-3 month?old lambs， and the clinical incidence rate of each farm was 0-16.33%， with an average incidence rate of 9.69%， which was lower than the infection rate of ORFV.

Key words： Sore mouth disease; Epidemiology; PCR diagnosis; Pingnan County

屏南縣位于福建東北部鷲峰山脈中段，全縣草場(chǎng)總面積2.88萬(wàn)hm2，占山地面積的24.2%。天然草場(chǎng)年日照平均總時(shí)數(shù)為1720 h，年活動(dòng)積溫為4565.6℃，冬暖夏涼，十分有利于牧草生長(zhǎng)，為肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了得天獨(dú)厚的資源。近年來(lái)，屏南縣肉羊產(chǎn)業(yè)的規(guī)模養(yǎng)殖已初見成效，百頭以上的規(guī)模養(yǎng)羊場(chǎng)約占屏南縣年末存欄總數(shù)的80%[1]。

羊口瘡病是由羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）感染引起羊急性、接觸性人畜共患病，患病羔羊的采食和吸吮乳汁受到嚴(yán)重影響，還易并發(fā)其他疫病，是造成養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要疫病之一[2]。目前缺乏用于臨床治療羊口瘡病的特效藥，采用取弱毒活疫苗進(jìn)行防治也存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，造成了該病防治的困難[3]。因此，開展羊口瘡病的流行病學(xué)調(diào)查，掌握病毒在羊群中的分布，是預(yù)防疾病的關(guān)鍵舉措[4-5]。為了解屏南縣養(yǎng)殖羊群的羊口瘡病分布與發(fā)病情況，在全縣范圍內(nèi)采用PCR方法開展羊口瘡病原的診斷，為該病的科學(xué)防治提供參考依據(jù)。

1?材料與方法

1.1病樣采集及流行病學(xué)調(diào)查

以2018年3月至6月間縣域內(nèi)12份臨床診斷為羊口瘡病的病羊?yàn)檠芯繉?duì)象，每個(gè)病例分別采集口、唇部結(jié)痂病變組織約100 mg和抗凝頸靜脈血0.5 mL。采集的組織加入約2 mL生理鹽水，研磨后收集勻漿1 mL，-20℃保存?zhèn)溆?病例頸靜脈血放置于2 mL滅菌離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2病毒基因組DNA提取病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司，病變組織樣本取200 uL勻漿液，血液取200 uL，均按照試劑盒的操作說(shuō)明分別進(jìn)行各樣品病毒基因組DNA的提取，提取的病毒基因組DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3羊口瘡病毒（ORFV）PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)與反應(yīng)體系

用于羊口瘡診斷的PCR引物參考顏新敏等[5]設(shè)計(jì)，目的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為507 bp。上游引物為：5′-CGAACTTCCACCTCAACCACTCC-3′，下游引物為：5′-CCTTGACGATGTCGCCCTTCT-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系為：提取的病毒基因組DNA 模板2 uL，2×Premix Taq酶（北京全式金生物科技有限公司）10 uL，上下游引物（25 pmol·uL-1）各1 μL，無(wú)菌ddH2O 6 uL。PCR反應(yīng)條件：94℃變性2 min，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增（94℃50 s、56℃40 s、72℃30 s），72℃延伸5 min，4℃1 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4?羊口瘡病毒（ORFV）的PCR檢測(cè)

分別以12份羊口瘡病例的病變組織、血樣提取的病毒基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以等量無(wú)菌ddH2O替代模板設(shè)置空白對(duì)照，擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳。

1.5?屏南縣羊口瘡病毒（ORFV）流行病學(xué)調(diào)查

于2018年7月至10月，在屏南縣縣域內(nèi)6個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)百頭以上規(guī)模戶進(jìn)行羊口瘡病的流行病學(xué)調(diào)查，每個(gè)羊場(chǎng)按存欄量的30%進(jìn)行隨機(jī)抽樣。抽中的羊只利用加抗凝的一次性采血針采集0.5 mL頸靜脈血，-20℃存放備用。檢測(cè)方法參照以上方法。

2?結(jié)果與分析

2.1?羊口瘡病毒（ORFV）的PCR檢測(cè)結(jié)果

由圖1可知，12份病例的病變組織、血樣提取的病毒基因組DNA樣品均擴(kuò)增出約500 bp片段，與預(yù)期片段大小一致，空白對(duì)照則無(wú)條帶。表明引起屏南縣臨床羊口瘡病的病原為羊口瘡病毒（ORFV），該P(yáng)CR診斷方法可用于臨床羊口瘡病的病原診斷，利用PCR技術(shù)可以檢測(cè)羊只血液羊口瘡病毒（ORFV）的感染情況。

2.2?屏南縣羊口瘡病毒（ORFV）的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

屏南縣6家存欄量百頭以上養(yǎng)羊規(guī)模場(chǎng)（戶）的羊口瘡病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果見表1。由表1可知，各養(yǎng)殖戶羊群均存在羊口瘡病毒的感染，感染率為14.63%～33.33%，平均感染率為25.99%，說(shuō)明羊口瘡病在屏南縣廣泛存在且感染率較高。抽樣調(diào)查的群體中有羊口瘡臨床病癥的羊只均為1～3月齡羔羊，各養(yǎng)殖場(chǎng)臨床發(fā)病率為0～16.33%，平均發(fā)病率為9.69%，低于羊群羊口瘡病毒（ORFV）的感染率，這主要是由于3月齡以上的感染羊只并非臨床發(fā)病羊只。經(jīng)過對(duì)抽樣羊只個(gè)體的對(duì)比，臨床發(fā)病羊只血液羊口瘡病毒（ORFV）的PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)了PCR技術(shù)對(duì)羊口瘡病毒（ORFV）診斷的準(zhǔn)確性。

3?討論

我國(guó)多地均有羊口瘡病的報(bào)道，給養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。在臨床上，羊只感染羊口瘡病后的癥狀與羊痘、口蹄疫等疫病的癥狀非常相似，特別是存在繼發(fā)或混合感染時(shí)，更增加了臨床診斷的難度

[7]。因此，能準(zhǔn)確對(duì)臨床感染病羊進(jìn)行病原確診以及定期調(diào)查羊口瘡病原在羊群中的分布是科學(xué)防治該疫病的關(guān)鍵[8]。利用電鏡、病毒分離等常規(guī)病毒診斷方法確診羊口瘡病毒費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要昂貴的設(shè)備，不適合在臨床診斷中應(yīng)用，而血清學(xué)診斷往往存在交叉反應(yīng)[9]。目前常利用羊口瘡病毒（ORFV）的特異保守序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行羊口瘡病毒的臨床確診[4-5]。常亮等[7]研究表明利用PCR方法檢出羊口瘡病毒（ORFV）的最低量為5 pg。林裕勝等[10]建立的羊口瘡病毒（ORFV）和絲狀支原體雙重PCR方法對(duì)羊口瘡病毒（ORFV）的最低檢測(cè)出量為3.8×104 Copies·uL-1，具有良好的特異性和敏感性。本研究表明羊口瘡發(fā)病羊只的病變組織和血樣的PCR檢測(cè)結(jié)果均為100%陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)了利用PCR技術(shù)在臨床上檢測(cè)羊口瘡病毒，具有快速、簡(jiǎn)單和準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，且其對(duì)試驗(yàn)條件要求較低，適用于一般實(shí)驗(yàn)室診斷。

羊口瘡病在屏南縣養(yǎng)殖羊群中的流行由來(lái)已久，2007年蘇雅英[11]在屏南縣屏城鄉(xiāng)散養(yǎng)戶中臨床診斷了羊口瘡病的疑似病例，但缺乏對(duì)病原的確診認(rèn)定。董曉寧等[4]首次在福建省開展了羊口瘡病的流行病學(xué)調(diào)查，表明該病在福建省的發(fā)病率為10%～20%，與本研究調(diào)查的屏南縣羊口瘡病發(fā)病率為0～16.33%的結(jié)果較為一致。屏南縣羊口瘡病的流行病調(diào)查結(jié)果表明羊群羊口瘡病毒（ORFV）的感染率高于發(fā)病率，常亮等[7]對(duì)甘肅東部地區(qū)羊口瘡病毒PCR檢測(cè)調(diào)查表明該地區(qū)羊群羊口瘡感染率遠(yuǎn)高于發(fā)病率，與本研究結(jié)果一致。分析認(rèn)為造成這一現(xiàn)象的原因：一方面是由于部分羊只發(fā)病的臨床癥狀輕，造成臨床診斷的漏診，另一方面放牧羊口瘡病多發(fā)于6月齡以內(nèi)的羔羊，但病毒會(huì)在6月齡以上的羊群中長(zhǎng)期攜帶[7]。

目前臨床治療羊口瘡的特效藥尚缺乏，且通過藥物治療傳染性疫病也并不經(jīng)濟(jì)，通過疫苗接種仍然是免疫防治羊口瘡病的主要方法[12]。但由于羊口瘡病毒免疫的特殊性和其他一些原因，至今為止尚未研制成功安全、高效的羊口瘡病毒疫苗，臨床上常用的弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)等缺點(diǎn)[13]。因此，在生產(chǎn)中科學(xué)防控羊口瘡病的先決條件是掌握羊口瘡病毒（ORFV）在羊群中的流行情況，在此基礎(chǔ)上加強(qiáng)對(duì)易感羔羊的照料，對(duì)發(fā)病羊只及時(shí)治療，隔離帶毒羊群和易感羊群，逐步淘汰老、弱帶毒羊只，定期消毒以減少病毒在羊群中的感染機(jī)會(huì)。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）