不同酶解膠原肽的制備及抗氧化活性研究

王 晴，曹穩(wěn)根，錢玉梅，李紅俠，陳紅玲，郝 麗

(宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000)

膠原蛋白是由3條α-肽鏈相互纏繞而形成的螺旋結(jié)構(gòu)的纖維狀蛋白質(zhì).膠原蛋白廣泛分布于動物的皮膚、軟骨、韌帶、血管、肌腱等組織和器官中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞、支撐器官和保護機體的作用[1-2].膠原蛋白中蘊藏著許多生物活性肽，其是由膠原蛋白經(jīng)酶降解得到的一系列由3～20個氨基酸組成的多肽，在體內(nèi)的生理功能較穩(wěn)定且易被腸道吸收，主要被應(yīng)用于生物、醫(yī)療、食品和美容等方面，用來治療骨質(zhì)疏松，保護胃黏膜和抗?jié)儯龠M皮膚膠原代謝等[3].酶具有專一性、條件溫和、過程安全、可準(zhǔn)確控制水解程度等特點，且對氨基酸結(jié)構(gòu)破壞和構(gòu)型影響較小，因此酶解法是目前制備多肽應(yīng)用最廣、最有效的方法[4].王成成[5]用蛋白酶酶解膠原蛋白60 min和120 min制成羅非魚魚皮膠原肽，綜合評價后表明，酶解60 min的膠原肽活性較大.由此可見，膠原肽活性跟其酶解因素有關(guān)，但酶種類對酶法所制備的膠原肽抗氧化活性的影響尚未見報道.

自由基是共價鍵發(fā)生均裂而形成的具有不成對電子的原子或基團，其化學(xué)性質(zhì)極活潑.如果體內(nèi)大量自由基存在，會與脫氧核糖核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，造成器官、組織和細(xì)胞的功能衰退，引起一系列慢性疾病，并且加速衰老.而抗氧化劑能夠和自由基發(fā)生氧化反應(yīng)，減少人體內(nèi)自由基對機體的損傷[6].DPPH是一種氮中心自由基，對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子具有攻擊作用，從而引發(fā)機體病變[7]；過氧化氫是一種非活性成分，廣泛存在于生物體和食物中，當(dāng)體系中存在還原性金屬離子時，過氧化氫就會釋放出氧化能力很強的羥自由基，羥自由基是一種較活潑、毒性較強的活性氧自由基，能夠氧化機體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等生物大分子，造成人體組織中脂質(zhì)的過氧化、核酸的斷裂、多糖和蛋白質(zhì)的分解，從而導(dǎo)致機體受損和基因突變，引起機體衰老和癌變[8]；超氧陰離子自由基是生命體代謝過程中產(chǎn)生的一種氧化能力較強的活性氧自由基，在機體中存在壽命最長，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，加快機體衰老過程，并可誘發(fā)皮膚病變、心血管疾病、癌癥等[9].

天然的抗氧化肽能清除自由基，且無毒副作用，對機體的抗衰老能力具有重要的作用.多肽抗氧化活性主要與其氨基酸序列、結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量和疏水性等相關(guān)，而這些因素受酶解方式的影響.胡楊等人研究表明，不同水解程度的膠原蛋白肽性能存在差異，使用不同蛋白酶進行水解，在水解程度相同時，所得膠原蛋白肽的性能也不相同[1]；肖嵐等人研究表明5種蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的水解產(chǎn)物抗氧化活性強弱不同[10].

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

羅非魚魚皮購于湖北發(fā)夏食品有限公司；羥脯氨酸、氯胺T、石油醚、對二甲氨基苯甲醛、三氯乙酸、酪蛋白、甘氨酸、30%雙氧水、硫酸亞鐵、硫酸銅、水楊酸、抗壞血酸、焦性沒食子酸、DPPH均為分析純，購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶購于合肥博美生物科技有限公司.

1.2 試驗儀器

ED56精密烘箱(德國binder公司)；K1100全自動凱氏定氮儀(山東海能科學(xué)儀器有限公司)；UV-2450紫外分光光度計(日本島津公司).

1.3 試驗方法

1.3.1 魚皮膠原蛋白的制備

魚皮去除魚鱗后清洗烘干，粉碎，用石油醚浸泡，并于室溫下磁力攪拌6 h，然后用蒸餾水沖洗三遍，烘干即得脫脂魚皮粉末.將脫脂魚皮粉末按1∶100放入含有1 g/L胃蛋白酶的預(yù)冷的0.5 M乙酸溶液，連續(xù)攪拌提取48 h，20 000 g離心1 h，取上清，緩慢加入NaCl至最終濃度為0.9 M，鹽析過夜，然后2500 g離心30 min，棄上清.將沉淀溶解于含1.0 M NaCl的Tris-HCl緩沖液(pH =7.5)中，再次于20 000 g離心1 h，取上清對0.1 M乙酸透析脫鹽48 h，凍干即為羅非魚魚皮膠原蛋白[11].

1.3.2 不同酶解膠原肽的制備

取羅非魚魚皮膠原蛋白1 g，加入100 mL磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L，pH= 8.0)制成10 g/L的膠原蛋白溶液，各取30 mL分別加入胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶若干(酶活控制在3 600 U/mL)，調(diào)pH至8.0，47℃下攪拌酶解3.5 h，100℃滅酶10 min，冷卻后8 000 r/min離心4 min，取上清分別得到胰蛋白酶膠原肽、堿性蛋白酶膠原肽、中性蛋白酶膠原肽[4].

1.3.3 不同酶解膠原肽水解度測定

采用茚三酮比色法測定三種膠原肽水解度DH(Degree of hydrolysis)[5]，按(1)式計算：

DH(%)=(A-B)/C×100

(1)

式中A為蛋白酶水解后氨基氮的含量, B為原料中游離氨基氮的含量，C為原料經(jīng)強酸水解后總游離氨基氮的含量.

1.3.4 不同酶解膠原肽對DPPH自由基的清除作用

取5支比色管，加入3 mL 0.05 mmol/L的DPPH溶液，再分別加入質(zhì)量濃度分別為0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L的胰蛋白酶膠原肽3 mL，搖勻，靜置30 min，于517 nm處測其吸光度Ai；另取5支比色管，分別加入3 mL無水乙醇和3 mL上述質(zhì)量濃度樣液，混合均勻，于517 nm處測其吸光度Aj；另取比色管，加入3 mL無水乙醇和3 mL DPPH溶液，搖勻，于517 nm處測定其吸光度A0.以Vc做對照，按相同方法測定堿性蛋白酶膠原肽和中性蛋白酶膠原肽對DPPH自由基的清除率[12]，按(2)式計算，并重復(fù)3次取其平均值.

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(2)

1.3.5 不同酶解膠原肽對·OH自由基的清除作用

取6支比色管，加入不同質(zhì)量濃度(0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L、0.8 g/L、0.9 g/L、1.0 g/L)的胰蛋白酶膠原肽2 mL，再分別加入0.5 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液、2 mL 1.5 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和0.5 mL 0.1%的H2O2溶液，搖勻，并置于37℃水浴中反應(yīng)15 min，在510 nm處測定其吸光度Ai；以等量蒸餾水代替H2O2，測其吸光度Aj；以等量蒸餾水代替不同質(zhì)量濃度的胰蛋白酶膠原肽，測其吸光度A0.用相同方法測定其他兩種膠原肽及Vc對·OH的清除效果[13]，按(3)計算，并重復(fù)3次取其平均值.

·OH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/ A0]× 100 %

(3)

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類對膠原肽水解度的影響

蛋白質(zhì)的水解度DH代表蛋白質(zhì)被酶催化水解的程度.在酶解法制備膠原肽中，水解程度至關(guān)重要，合適的水解程度不會破壞水解物的組成和結(jié)構(gòu)，可保留甚至增加其特性；過度水解可能會使其性能，尤其是功能特性和生物活性降低甚至完全喪失[1].酶種類對膠原肽水解度的影響見圖1.

膠原肽

圖1 酶種類對膠原肽水解度的影響

由圖1可知，堿性蛋白酶水解羅非魚魚皮膠原蛋白得到的膠原肽的水解度最高，中性蛋白酶次之，胰蛋白酶最低，說明堿性蛋白酶的水解能力較強，與胡楊等人研究的酶法制備草魚魚鱗膠原肽結(jié)果一致[1].

2.2 不同酶解膠原肽對DPPH自由基清除效果的影響

不同酶解膠原肽對DPPH自由基清除作用的影響效果見圖2.由圖2可知，堿性蛋白酶膠原肽對DPPH自由基的清除率隨濃度增大一直呈持續(xù)增長的趨勢.在濃度為0.5 g/L時清除率為49.92%，濃度為2.5 g/L時，清除率達(dá)到98.93%；胰蛋白酶膠原肽對DPPH自由基的清除率從0.5 mg/mL時的47.21%增加到2.5 mg/mL時的88.73%；而中性蛋白酶膠原肽對DPPH自由基的清除率從0.5 mg/mL時的45.39%增加到2.5 mg/mL時的93.90%，且在濃度0.5～1.0 g/L范圍內(nèi)增加緩慢，而后增加速率較快.可明顯看出，堿性蛋白酶膠原肽對DPPH自由基的清除率高于其他兩種酶，且在濃度為2.5 g/L時，清除作用超過Vc.

圖2 不同酶解膠原肽對DPPH自由基清除作用的影響

2.3 不同酶解膠原肽對·OH自由基清除作用的影響

不同酶解膠原肽對·OH自由基清除作用的影響效果見圖3.由圖3可知，堿性蛋白酶膠原肽在濃度2～10 g/L范圍內(nèi)，清除率從68.52%上升到95.28%，且在濃度2～8 g/L范圍內(nèi)增加較快，后增加緩慢；中性蛋白酶膠原肽對·OH自由基的清除率比堿性蛋白酶膠原肽清除率低，隨濃度上升呈增加趨勢，清除率從46.22%增加到85.79%，在2～5 g/L濃度范圍內(nèi)增加趨勢較明顯，清除率達(dá)到73.82%后增加緩慢；胰蛋白酶膠原肽對·OH自由基的清除率略低于中性蛋白酶膠原肽.堿性蛋白酶膠原肽、中性蛋白酶膠原肽、胰蛋白酶膠原肽對·OH自由基的清除率在濃度為10 g/L時均達(dá)到最高，分別為95.28%、85.79%、84.73%，說明三種膠原肽對·OH具有一定的清除效果，堿性蛋白酶膠原肽對·OH的清除效果最好，且當(dāng)濃度為10 g/L時，其清除率與Vc相當(dāng)，胰蛋白酶膠原肽和中性蛋白酶膠原肽對羥自由基的清除作用相差不大.

圖3 不同酶解膠原肽對·OH自由基清除作用的影響

2.4 不同酶解膠原肽對自由基清除作用的影響

圖4 不同酶解膠原肽對O2-·自由基清除作用的影響

3 結(jié)論與討論