益生菌阿膠低肽復合乳飲料調(diào)配工藝

劉星，秦楠，李冠文，劉鍵輝，葉丹瑩，曹華麒

（山西中醫(yī)藥大學制藥與食品工程學院，太原030619）

0引言

阿膠富含有明膠、蛋白質(zhì)等多種有效成分，有增強免疫、抗疲勞、抗輻射等作用[1-2]。紅棗具有安神健脾、補腎等多種保健食療功能，一直以來被人們視為極佳滋補品[3-4]。韓雪等利用乳酸菌發(fā)酵紅棗汁發(fā)現(xiàn)，游離態(tài)酚酸含量顯著提高并表現(xiàn)出較強的抗氧化活性[5]。黑枸杞具有提高免疫、抗氧化、滋肝等功能[6]。楊潔與梁小軍分別從黑枸杞中提取總黃酮、多糖物質(zhì)，其抗氧化與免疫活性顯著提高[7-8]。林燕文等對乳酸菌發(fā)酵枸杞泡菜研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖可為乳酸菌提供碳源，提高產(chǎn)酸速度與產(chǎn)酸力[9]。基于阿膠低聚肽的研究，以牛奶、阿膠低肽粉、紅棗與黑枸杞液為發(fā)酵基液，優(yōu)化了復合乳飲料的配方，并對穩(wěn)定性進行了研究，為藥食同源原料的開發(fā)利用提供了一定的科學依據(jù)。

1實驗

1.1材料與儀器

紅棗，黑枸杞，阿膠，阿膠低肽粉（低肽質(zhì)量分數(shù)為58%）（實驗室自制）；雙歧桿菌（Bifidobacterium）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）∶嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)=1∶1；胃蛋白酶1×105 U/g，胰蛋白酶1×104 U/g，木糖醇，檸檬酸，復合香精（菠蘿香精：桔子香精=1∶1），瓜爾膠，黃原膠，蔗糖酯均為食用級。

RRHP-100萬能高速粉碎機，歐凱萊芙香港實業(yè)公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；SPT20消解爐，北京京通順康儀器有限公司；SPD 60自動定氮儀，北京三品科創(chuàng)儀器有限公司；GZX-9140MBE電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；N-1100V-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；DZF-6050真空干燥箱，嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司；DY04-13-44-00高壓滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1工藝流程

1.2.2操作要點

（1）阿膠低肽粉的制備。阿膠粉用超聲波輔助胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解，酶解條件為加酶量分別0.02 g、0.05 g，先后調(diào)節(jié)溫度45℃和42℃，p H值為2.0和8.0，時間2.5 h和3.5 h，酶解后將酶解液于100℃滅酶10 min，然后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，55℃濃縮至原體積的30%左右，冷凍干燥后即得阿膠低肽粉。

（2）復合發(fā)酵液的制備。以牛奶、阿膠低肽粉、紅棗和黑枸杞液為主原料，用雙歧桿菌與傳統(tǒng)乳酸菌作為發(fā)酵菌種，發(fā)酵工藝為牛奶、紅棗汁與黑枸杞汁體積比40∶20∶10(mL)，加水補足至100 mL，按5 g/100 mL添加阿膠低肽粉，菌種復配比（益生菌∶傳統(tǒng)乳酸菌=1∶1），接種量3%，蔗糖添加量2 g/100 mL，發(fā)酵溫度37℃，時間6 h。

（3）阿膠低肽復合乳飲料的制備。將復合發(fā)酵液用高速攪拌器攪拌破乳10 min，加入木糖醇、檸檬酸、及復合香精等進行調(diào)配，并按一定比例添加穩(wěn)定劑，在85℃條件下殺菌15 min，冷卻后即得阿膠低肽復合乳飲料。

1.2.3阿膠低肽復合乳飲料調(diào)配的單因素實驗

感官評分為評價指標，分別考察木糖醇、檸檬酸、蜂蜜及復合香精的添加量對復合乳飲料感官品質(zhì)的影響，不同因子梯度條件如表1所示。

表1單因素水平設計

1.2.4復合乳飲料響應面優(yōu)化實驗

基于單因素試驗結(jié)果，選用中心組合實驗Box-Behnken設計方案，選取木糖醇、檸檬酸、復合香精添加量3個變量，以A，B，C表示；并以+1，0，-1分別代表其變量的水平，按方程x=(X-X 0)/△X對自變量進行編碼。其中，x為變量的編碼值；X為變量的真實值；X 0為實驗中心點變量的真實值；△X為變量的步長變化；感官評分Y為響應值，如表2所示。

1.2.5感官評價標準

表2響應面實驗因素水平編碼 g

復合乳飲料感官評價依據(jù)中華人民共和國標準GB/T21732-2008《含乳飲料》及相關(guān)文獻[10-11]，請20位均接受過《食品感官分析》課程培訓的專業(yè)技術(shù)人員，按照表3感官評分標準進行評價，具體評分標準如表3所示。

表3復合乳飲料感官評分標準

1.2.6正交優(yōu)化穩(wěn)定性實驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以感官評分為評價指標，選擇瓜爾膠添加量（A）、黃原膠添加量（B）、蔗糖酯添加量（C）為主要因素，采用L 9（33）正交試驗設計，對各因素水平進行優(yōu)化，正交試驗因素與水平如表4所示。

表4復合乳飲料穩(wěn)定性正交試驗因素與水平 g

1.2.7阿膠低肽復合乳飲料穩(wěn)定性的評價標準

復合乳飲料屬多相體系，成分復雜，穩(wěn)定性是影響產(chǎn)品的主要因素[12-13]。將穩(wěn)定劑溶于熱水充分溶解后，與復合乳飲料按一定比例混勻，靜置24 h后觀察穩(wěn)定性，并對復合乳飲料的沉淀、乳清析出以及脂肪上浮等情況進行評價，滿分100分，具體評分標準如表5所示。

1.3理化及微生物指標測定

利用蘆丁、葡萄糖作為標品，采用分光光度法對黃酮[14]及多糖[15]質(zhì)量分數(shù)進行測定；凱式定氮法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)[16]。

活菌數(shù)的測定：采用國標GB 4789.35-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》中乳酸細菌培養(yǎng)基（MRS）培養(yǎng)基的方法對益生菌復合乳飲料乳酸菌數(shù)量進行檢測，將樣品涂布接種到MRS培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48 h后，計數(shù)[17]。

大腸菌群的測定：采用國標GB 4789.3-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》中平板計數(shù)的方法對益生菌復合乳飲料的大腸桿菌數(shù)量進行檢測，將樣品傾注接種到結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48 h后,計數(shù)[18]。

1.5數(shù)據(jù)分析

表5復合乳飲料穩(wěn)定性的評分標準

本研究所有的試驗數(shù)據(jù)均使用Origin和Design-Expert（version8.0.6）統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，運用最小差異顯著法（LSD）進行差異顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1阿膠低肽復合乳飲料單因素實驗

2.1.1木糖醇添加量對復合乳飲料感官質(zhì)量的影響

如圖1所示，隨木糖醇添加量的增加，感官評分呈先升后降的趨勢，由于木糖醇的增加，甜度增大導致飲料過甜，逐漸出現(xiàn)酸甜比不協(xié)調(diào)。因此，木糖醇添加量選擇4 g/100 mL為宜。

圖1木糖醇添加量對感官質(zhì)量的影響

2.1.2檸檬酸添加量對復合乳飲料感官質(zhì)量的影響

如圖2所示，隨檸檬酸添加量的增加，感官評分先增大后減少，飲料酸味逐漸增大，當添加量大于0.15 g/100 mL時，評分呈下降趨勢，可能是過酸造成口感失調(diào)，因此，檸檬酸添加量選擇0.15 g/100 mL為宜。

圖2檸檬酸添加量對感官質(zhì)量的影響

2.1.3蜂蜜添加量對復合乳飲料感官質(zhì)量的影響

如圖3所示，感官評分隨蜂蜜添加量的增加呈逐漸增大而后下降趨勢，當添加量為8 g/100 mL時達到最高，在此條件下，乳飲料香甜不膩，繼續(xù)添加蜂蜜，蜂蜜的味道會掩蓋其他風味，表現(xiàn)出適度過高。因此，蜂蜜添加量選擇8 g/100 mL為宜。

2.1.4復合香精添加量對復合乳飲料感官質(zhì)量的影響

圖3蜂蜜添加量對感官質(zhì)量的影響

如圖4所示，感官評分隨著復合香精添加量的增加呈先上升再下降的趨勢，香味由淡逐漸突出，但當添加量超過0.06 g/100 mL時，香精味濃厚，口感較差，因此，復合香精添加量選擇0.06 g/100 mL為宜。

圖4復合香精添加量對感官質(zhì)量的影響

2.2復合乳飲料響應面試驗結(jié)果

2.2.1響應面試驗設計與結(jié)果

如表6所示，17個試驗點中12個是析因點，5個是零點，析因點是自變量取值在X 1，X 2，X 3所構(gòu)成的三維頂點，零點表示區(qū)域的中心點，其中重復零點實驗5次，用以估算試驗誤差。

2.2.2模型的建立及其顯著性檢驗

利用Design-Expert（version8.0.6）軟件對表3試驗數(shù)據(jù)通過多元回歸擬合，得到阿膠低肽復合乳飲料的感官評分（Y）對自變量木糖醇添加量（A）、檸檬酸添加量（B）、復合香精添加量（C）的回歸方程為

Y=93-1.5A-0.25B-2.5C+1.5AB-3.0AC+4.5BC-5.25A2-8.75B2-7.25C2。

由表7可以看出，模型F值為25.31，P＜0.0001，說明此模型極顯著，模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率，此模型失擬項P=0.5645＞0.05，表明模型不顯著，擬合概率高，運用到試驗中誤差小。該模型的相關(guān)系數(shù)R 2=0.9702，且模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.9319，說明此模型能用于93.19%的試驗結(jié)果解釋，進一步說明了回歸方程的擬合程度較好。

由表7中的F值的大小可以判斷各因素對益生菌復合發(fā)酵乳飲料質(zhì)量影響的強弱，F(xiàn)值越大，說明該因素對于感官評價的影響程度越大。故根據(jù)上表可得出各因素對于復合乳飲料感官評價的影響程度大小依次為復合香精添加量（C）＞木糖醇添加量（A）＞檸檬酸添加量（B）。

表6 Box-Behnken實驗設計及結(jié)果

根據(jù)上述回歸方程繪制出響應面圖，以確認復合香精、木糖醇、檸檬酸添加量3個因素對復合乳飲料質(zhì)量的影響，如圖5所示。

圖5（a）所示，木糖醇-檸檬酸添加量對復合乳飲料感官評分的交互作用不顯著。隨著兩者添加量逐漸增加，感官評分先增大然后減小。由圖5（b）所示，木糖醇-復合香精添加量對感官評分的交互作用顯著（P＜0.05）。由圖5（c）所示，檸檬酸-復合香精添加量對感官評分的交互作用極顯著（P＜0.01），通過響應面

圖5各因素交叉作用對復合乳飲料的感官評分影響的響應面和等高線

表7回歸模型方差分析

分析，響應面的坡度較陡。感官評分隨著兩者的提高而增加，當檸檬酸達到0.16 g、復合香精達到0.07 g時增長趨勢變緩，開始呈現(xiàn)下降的趨勢。

2.2.3驗證實驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，最佳的制備工藝條件為木糖醇添加量1.96 g，檸檬酸添加量0.166 g，復合香精添加量0.076 g，在此條件下的感官評價得分為93.5分?？紤]實際操作的方便性，將最適參數(shù)修正為：木糖醇添加量2 g，檸檬酸添加量0.15 g，復合香精添加量0.08 g，為了驗證模型預測的準確性，重復實驗3次，所得平均值與理論預測值非常接近，且相對誤差小于2%，無顯著性差異（P＞0.05），說明重復性良好。

2.3正交優(yōu)化穩(wěn)定性實驗結(jié)果

由表8可以看出，各因素對感官影響的主次順序為C＞B＞A，即蔗糖酯的添加量復合乳飲料的穩(wěn)定性影響最大，依次是黃原膠、瓜爾膠添加量，最優(yōu)組合為A 1B2C 3，即瓜爾膠添加量為0.04 g/100 mL，黃原膠添加量為0.08 g/100 mL，蔗糖酯添加量為0.3 g/100 mL。在此最佳條件下，產(chǎn)品的感官評分為91分。由表9可知，因素A，B，C對穩(wěn)定性評分的影響均有顯著性差異（P＜0.05）。

表8復合乳飲料調(diào)配優(yōu)化正交實驗結(jié)果

表9正交實驗結(jié)果方差分析

2.4儲藏期內(nèi)益生菌復合乳飲料活菌數(shù)的變化

由圖6可以看出，益生菌復合乳飲料中活菌總數(shù)隨著儲藏時間的延長，在2～4 d期間菌數(shù)增長量大、增速快，隨著儲藏時間延長菌數(shù)逐漸下降，這可能與菌體代謝產(chǎn)物大量積累形成的酸性環(huán)境對其菌體本身產(chǎn)生抑制，或與菌體進入老化、衰亡期導致負增長有關(guān)[17]。

2.5產(chǎn)品質(zhì)量評價

圖6儲藏期內(nèi)益生菌復合乳飲料活菌數(shù)的變化

2.5.1感官指標

色澤：均勻一致，淺褐色。組織狀態(tài)：細膩、均勻，允許有少量乳清析出。滋味：酸甜適口，口感絲滑，有酸奶香氣，有清爽的紅棗與黑枸杞味，無異味。

2.5.2理化指標

黃酮質(zhì)量分數(shù)為0.54%，多糖為9.32%，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2.2±0.13 g/100 mL。

2.5.3微生物指標

乳酸菌總數(shù)為3.6×107 mL-1；菌落總數(shù)＜100 mL-1；大腸菌群（最近似值）≤3 mL-1；致病菌未檢出。

3結(jié)論

牛奶、紅棗汁與黑枸杞液體積比40∶20∶10(mL)，添加阿膠低肽粉5 g/100 mL的基礎上，通過單因素和響應面試驗確定了益生菌發(fā)酵復合乳飲料的最佳配方：木糖醇2 g/100 mL，檸檬酸0.15 g/100 mL，復合香精0.08 g/100 mL，蜂蜜8 g/mL。穩(wěn)定性作為影響生產(chǎn)的主要因素之一，在原料配比最優(yōu)基礎上，采用添加復配的穩(wěn)定劑的方式可有效防止出現(xiàn)分層、沉淀等現(xiàn)象。通過穩(wěn)定性實驗，選擇瓜爾膠0.04 g/100 mL，黃原膠0.08 g/100 mL，蔗糖酯0.3 g/100 mL。通過測定復合乳飲料理化指標與微生物指標，黃酮質(zhì)量分數(shù)0.54%，多糖9.32%，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度2.2 g/100 mL。乳酸菌總數(shù)為3.6×107 mL-1，菌落總數(shù)＜100 mL-1，致病菌未檢出。終制得的成品具有獨特風味，酸甜適宜，口感佳穩(wěn)定性好的保健乳飲料。

通過乳酸菌發(fā)酵，紅棗中游離酸酚、黃酮類物質(zhì)含量可顯著提高，具有較強的抗氧化活性，結(jié)合黑枸杞多糖抗氧化活性及增強免疫力活性，后期可通過動物模型對產(chǎn)品的功能活性進一步驗證。