羊乳中牛乳成分的直接實(shí)時(shí)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)

澹臺(tái)瑋，徐秦峰，馬西亞，張文娟

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院國(guó)家羊乳制品加工技術(shù)研發(fā)專(zhuān)業(yè)中心，西安710021）

0引言

乳制品營(yíng)養(yǎng)豐富，易被人體消化吸收，同時(shí)作為加工食品原輔料的重要來(lái)源，在世界各地有著巨大的消費(fèi)群體[1]。尤其是羊乳以其更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值使得其價(jià)格遠(yuǎn)高于牛乳[2]。一些不法商家為了尋求商業(yè)利益，在羊乳中摻入牛乳，以次充好，且摻入手段多樣，不易辨別。這種摻假行為不僅會(huì)給消費(fèi)者造成直接的經(jīng)濟(jì)損失，而且還涉及到某些特殊的醫(yī)療要求、食物過(guò)敏甚至是宗教信仰問(wèn)題[3]。因此，建立牛、羊源性的品種鑒別方法以保證乳品真實(shí)性是必要的。

目前用于乳制品來(lái)源鑒別方法主要有分析蛋白、脂肪和核酸的方法，這些方法在一定程度上都可以實(shí)現(xiàn)牛、羊乳品種鑒別[4]。但是，相比于蛋白質(zhì)和脂肪，核酸分子的穩(wěn)定性更高，且在個(gè)體細(xì)胞間具有良好的保守性[5-6]。因此基于DNA的檢測(cè)方法不僅適用于生乳樣品，也適用于熱加工的乳品[7]。基于核酸發(fā)展的牛、羊乳的品種鑒別技術(shù)有普通PCR[8]、real-time PCR[9]等，但大多操作繁雜，設(shè)備昂貴，且需專(zhuān)業(yè)操作人員才能完成。Notomi等[10]研發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）通過(guò)4條特異性引物，快速識(shí)別靶序列上的6個(gè)位點(diǎn)，結(jié)合具有鏈置換活性的DNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下，特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增核酸序列，已被成功應(yīng)用于物種鑒定。Deb R等[11]通過(guò)對(duì)LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)在2 h內(nèi)對(duì)羊奶/肉類(lèi)樣品中摻入5%牛成分的檢測(cè)。Cho A R等[12]建立了LAMP熔解曲線(xiàn)分析方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)8種肉制品進(jìn)行了識(shí)別和鑒定。然而，這些研究都需要進(jìn)行過(guò)程繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)的DNA提取過(guò)程，限制了對(duì)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的應(yīng)用。本研究建立了一種在不進(jìn)行DNA提取的情況下直接實(shí)時(shí)LAMP檢測(cè)方法，同時(shí)檢測(cè)時(shí)可以采用更少量的樣品，實(shí)現(xiàn)對(duì)羊乳及其制品中摻入牛乳成分的檢測(cè)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

鮮奶牛乳樣品，西安市未央?yún)^(qū)草灘奶牛場(chǎng)；鮮羊乳樣品-20℃保存?zhèn)溆茫惺?；用于?yàn)證引物特異性的非目標(biāo)DNA（雞、豬、馬、兔和鴿子）均購(gòu)于四川華漢三創(chuàng)有限公司；不同品牌的羊乳產(chǎn)品（液態(tài)乳、羊奶片、全脂羊乳粉、淡奶粉及配方奶粉），市售，用于驗(yàn)證所建立方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

模擬摻假樣品的制備：將牛乳按不同比例摻入羊乳中（100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%、0%），制備成具有不同含量的模擬摻假樣品。

1.2主要試劑和儀器

(1)試劑：磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根有限公司；甜菜堿（Sigma公司）；dNTP混合液，Bst 2.0 WarmStar DNA聚合酶，MgSO 4，均采自New England Biolabs。

(2)儀器：高速冷凍離心機(jī)（5424R），Eppendorf有限公司；瓊脂糖水平電泳儀（DYCP-31DN），北京六一生物科技有限公司；電熱恒溫水槽（DK-8D），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，熒光定量PCR儀（qTOWER 2.2），德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；超微量分光光度計(jì)（Q 6000），美國(guó)Quawell。

1.3 DNA提取

按照磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取新鮮乳品或乳粉中的DNA，采用超微量核酸定量?jī)x測(cè)定DNA的濃度和純度后，將DNA溶液稀釋到7 ng/μL，保存于-20℃冰箱中備用。

1.4 LAMP引物設(shè)計(jì)及篩選

本研究涉及的牛、羊特異性引物以線(xiàn)粒體保守序列為靶基因，依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則使用PrimerExplorerV4在線(xiàn)設(shè)計(jì)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的可行性驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)多次設(shè)計(jì)及篩選比對(duì)，最終使用SN/T 4419.21-2016[13]標(biāo)準(zhǔn)中的牛特異性引物及文獻(xiàn)報(bào)道的羊特異性引物[14]，如表1所示。引物由生工生物(上海)有限公司合成。

1.5 LAMP反應(yīng)體系建立

LAMP反應(yīng)體系為10μL，包括:1μL 10×Thermol Pol buffer，外引物F3和B3（10μmol/L）各0.2μL，內(nèi)引物FIP和BIP（40μmol/L）各0.2μL，1.4μL dNTPs（10 mmol/L），1.6μL甜菜堿（0.8M），0.4μL MgSO 4（100 mmol/L），0.4μL Bst DNA聚合酶（8 U/μL），20×Eva Green熒光染料0.25μL，加入待測(cè)DNA 1.2μL，以超純水為空白對(duì)照，最后用水補(bǔ)齊到10μL，混勻。反應(yīng)條件：64℃恒溫反應(yīng)45 min。

表1本實(shí)驗(yàn)中LAMP擴(kuò)增引物序列

1.6直接實(shí)時(shí)LAMP反應(yīng)體系建立

對(duì)于直接實(shí)時(shí)LAMP反應(yīng)體系，所有的待測(cè)樣品都不需要進(jìn)行DNA提取。首先取5μL樣品（對(duì)市售的羊奶粉，取0.1 g奶粉溶于1 mL水中混勻，制成液態(tài)乳）放入含有55μL磷酸鹽（PBS）緩沖液的PCR反應(yīng)管中，在98℃下孵育5 min，然后取1.2μL上層清液直接作為模板用于上述LAMP反應(yīng)。

1.7特異性試驗(yàn)

分別提取牛、羊、雞、豬、馬、兔、鴿子的DNA為模板，按照LAMP體系配置反應(yīng)液，加入不同模板DNA，在最適反應(yīng)溫度下擴(kuò)增，結(jié)果通過(guò)擴(kuò)增曲線(xiàn)及2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析鑒定，以驗(yàn)證LAMP引物的特異性。

1.8靈敏度試驗(yàn)

將DNA提取液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)狗磻?yīng)體系中DNA濃度分別為7、0.7、0.07、0.007、0.0007、0.00 007 ng/μL，將每個(gè)梯度的稀釋液取1.2μL作為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)檢測(cè)，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行單個(gè)物種DNA檢測(cè)靈敏度的測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1特異性檢測(cè)

采用牛、羊、雞、豬、馬、兔、鴿子等樣品DNA為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，以驗(yàn)證引物的特異性，擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖1所示，針對(duì)牛、羊源性成分設(shè)計(jì)的特異性引物，僅含有目標(biāo)成分DNA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，空白對(duì)照和其他動(dòng)物源性樣品均未發(fā)生擴(kuò)增，結(jié)合凝膠電泳結(jié)果顯示，只有牛、羊乳DNA中分別加入牛、羊特異性引物才出現(xiàn)典型的梯形條帶（圖1中的泳道1），與擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果一致，表明LAMP引物的特異性良好。

2.2靈敏度檢測(cè)

為了確定設(shè)計(jì)的LAMP方法能夠檢測(cè)到的牛、羊乳DNA的含量，將10倍稀釋的牛、羊源性成分DNA（7 ng/μL、0.7 ng/μL、0.07 ng/μL、0.007 ng/μL、0.0 007 ng/μL、0.00 007 ng/μL）分別用于LAMP反應(yīng)，以超純水作為空白對(duì)照。圖2結(jié)果表明，牛源性成分檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到0.07 pg/μL，羊源性成分檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到0.7 pg/μL，表明檢測(cè)體系具有較高的靈敏度。同時(shí)，牛、羊源性成分濃度與LAMP方法檢出時(shí)間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，隨著模板DNA濃度的降低，其檢出時(shí)間越長(zhǎng)。

圖1牛、羊源性成分LAMP引物特異性驗(yàn)證

圖2牛、羊源性成分LAMP反應(yīng)靈敏度檢測(cè)

2.3實(shí)時(shí)LAMP技術(shù)對(duì)摻假樣品檢測(cè)

考慮牛源性成分為羊乳中最為常見(jiàn)的摻假成分，為了確定其檢出限，將試劑盒提取的羊乳DNA稀釋液制成混合樣品（摻入牛乳DNA含量分別為100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%），使用牛特異性引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。從圖3可以看出，以不同比例的DNA混合液為模板，均可以出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，表明本方法對(duì)羊乳中摻入牛源性成分的檢測(cè)限為0.1%。

圖3牛羊乳DNA混合樣品中牛源性成分分析（1～9分別為摻入牛乳DNA比例為100%、80%、50%、10%、5%、1%，0.1%、0%和空白對(duì)照）

2.4直接實(shí)時(shí)LAMP技術(shù)對(duì)摻假樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證建立的直接實(shí)時(shí)LAMP方法的應(yīng)用性，將牛乳按不同比例摻入羊乳中（100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%、0%），制備成不同含量的混合樣品，每個(gè)樣品只需孵育5分鐘，使細(xì)胞裂解釋放出DNA，然后直接作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果如圖4所示，建立的直接實(shí)時(shí)LAMP方法可成功對(duì)乳制品進(jìn)行檢測(cè)，在不同比例的混合樣品中，該方法能檢測(cè)出羊乳中低至1%的牛乳成分，明顯低于由試劑盒提取的DNA制成混合樣品的檢出限。這是因?yàn)槿轶w系內(nèi)部的復(fù)雜性和乳中體細(xì)胞含量分布的不均勻性，將乳混和直接進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)會(huì)有部分損失。

圖4牛羊乳直接混合樣品中牛源性成分分析（1～9分別為摻入牛乳比例為100%、80%、50%、10%、5%、1%，0.1%、0%和空白對(duì)照）

2.5實(shí)際樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證直接實(shí)時(shí)LAMP方法對(duì)市售樣品檢測(cè)的適用性，采用上述建立的檢測(cè)體系對(duì)10種商業(yè)乳品進(jìn)行直接檢測(cè)，并通過(guò)試劑盒提取DNA的實(shí)時(shí)LAMP方法驗(yàn)證其準(zhǔn)確性，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，三個(gè)商業(yè)乳品(樣品1、2、3)標(biāo)記為只含有羊乳被加有牛特異性引物的LAMP反應(yīng)體系擴(kuò)增，顯示了在羊乳中不同程度的摻入牛乳成分；而標(biāo)識(shí)有生羊乳、乳清粉的樣品8僅檢測(cè)出牛乳成分，與標(biāo)識(shí)的主成分不符。盡管牛乳清粉在羊奶粉中的添加和替換一直存在，但是錯(cuò)誤標(biāo)注會(huì)對(duì)過(guò)敏人群造成危害[15-16]。同時(shí)，直接實(shí)時(shí)LAMP與經(jīng)DNA提取的實(shí)時(shí)LAMP反應(yīng)相比，結(jié)果完全一致，但檢測(cè)時(shí)間均有延遲，根據(jù)Tanner N A等人[17]對(duì)實(shí)時(shí)LAMP檢測(cè)研究表明，在某些引物不足或不純樣品（即樣品直接作為模板擴(kuò)增）情況下時(shí)間閾值范圍可在45-60 min，即為陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)比該研究表2可以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間可作為判定方式，即時(shí)間閾值小于60 min，為陽(yáng)性結(jié)果，反之，則為陰性。相較于通過(guò)試劑盒提取乳中DNA到LAMP結(jié)果檢測(cè)，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，縮短了時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)證明了直接實(shí)時(shí)LAMP方法在不提取DNA的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)牛羊乳成分進(jìn)行檢測(cè)的能力，并且適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。因此，本研究可實(shí)現(xiàn)對(duì)市售羊乳制品中摻入牛源性成分的檢測(cè)。

表2市售羊乳制品中牛、羊乳成分的LAMP檢測(cè)

3結(jié)論

現(xiàn)如今，羊乳及其制品摻入牛源性成分鑒別是乳制品質(zhì)量安全控制面臨的重要挑戰(zhàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3050-2016《羊奶真實(shí)性鑒定技術(shù)規(guī)程》規(guī)定，基于DNA的PCR方法，適用于生羊奶、UHT滅菌液態(tài)羊奶及羊奶粉中摻入牛源性奶成分的定性檢測(cè)。但是該P(yáng)CR方法需要專(zhuān)門(mén)的儀器以及復(fù)雜的DNA提取過(guò)程，無(wú)法實(shí)現(xiàn)羊奶真實(shí)性的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，限制了此方法的推廣應(yīng)用。LAMP法作為一種新興分子生物學(xué)方法，無(wú)需復(fù)雜的熱循環(huán)體系，僅在恒溫條件下擴(kuò)增，因其高效、快速、便捷的特點(diǎn)已應(yīng)用于動(dòng)物源性成分及多種致病菌的檢測(cè)[18-20]。本研究根據(jù)線(xiàn)粒體保守序列選取牛、羊特異性引物，建立了快速鑒別羊乳及其制品摻假的直接實(shí)時(shí)LAMP檢測(cè)方法，該方法具有良好的特異性，僅對(duì)含有目標(biāo)成分的樣品有擴(kuò)增，對(duì)其他動(dòng)物源性成分沒(méi)有交叉反應(yīng)。該方法對(duì)牛、羊源性成分的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.07 pg/μL和0.7 pg/μL。對(duì)羊乳中摻入不同比例牛乳混合物進(jìn)行5min熱處理，可檢測(cè)出摻入1%的牛乳，能夠滿(mǎn)足羊乳中摻入牛源性成分的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)市售羊乳及其制品中摻入牛源性成分的檢測(cè)，無(wú)需核酸提取的直接實(shí)時(shí)LAMP檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)LAMP技術(shù)結(jié)果相一致，在1 h內(nèi)即可對(duì)樣品進(jìn)行鑒定，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程，縮短了時(shí)間，同時(shí)直接實(shí)時(shí)LAMP技術(shù)無(wú)需核酸提取，減少了樣品DNA提取過(guò)程的污染風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)檢測(cè)時(shí)僅需采用更少量的樣品即可實(shí)現(xiàn)乳制品中牛、羊源性成分的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。