4-苯基丁酸早期處理對(duì)膿毒癥大鼠血管通透性的保護(hù)作用

朱 娛，劉良明，張 杰，吳 躍，田昆侖，彭小勇，向鑫明，李 濤

膿毒癥是臨床嚴(yán)重?zé)齻?、?chuàng)傷、革蘭氏陰性菌感染的主要并發(fā)癥[1]，血管通透性增加是膿毒癥重要的病理生理過程。在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中，由于微血管通透性增加，引起周圍局部組織水腫，導(dǎo)致有效循環(huán)血量減少，是引起多種重要器官功能障礙的主要原因[2-3]。目前針對(duì)膿毒癥血管通透性增加發(fā)生機(jī)制和防治措施有大量研究，但至今仍未找到有效防治措施，因此，尋找膿毒癥血管通透性變化的防治措施，對(duì)臨床嚴(yán)重?zé)齻?、膿毒癥器官功能障礙的防治有重要意義。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由多種因素致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境改變，從而引起蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，導(dǎo)致細(xì)胞損傷的病理過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于嚴(yán)重或長(zhǎng)期應(yīng)激將激活細(xì)胞凋亡信號(hào)觸發(fā)細(xì)胞死亡。大量研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，如神經(jīng)退行性疾病、腦缺血再灌注損傷和代謝性疾病[4-6]等。4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate，PBA)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑，是分子量較小的芳香族脂肪酸，目前PBA已被批準(zhǔn)用于臨床治療尿素循環(huán)障礙患者[7]。據(jù)報(bào)道，PBA可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，具有抗炎作用效應(yīng)[8-9]。實(shí)驗(yàn)室及其他研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥后多個(gè)器官組織存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，PBA是否對(duì)膿毒癥血管滲漏功能有保護(hù)作用，目前不清楚。為此，筆者用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture,CLP)復(fù)制大鼠膿毒癥模型，觀察PBA早期處理對(duì)膿毒癥大鼠血管通透性的保護(hù)作用，并初步探討其保護(hù)機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年SD大鼠，雌雄各半，12周齡，(220±20)g左右，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(渝)20170002，使用許可證號(hào)為SYXK(渝)20170002。

2 藥品與試劑

異硫氰酸熒光素標(biāo)記的牛血清白蛋白(albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate，F(xiàn)ITC-BSA)購自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)A9771；PBA購自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)P21005；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購自美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)L2630；ZO-1抗體購自中國(guó)博士德公司，兔抗大鼠，抗體使用濃度1∶200。

3 儀器

F4500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；SP5 II激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)；BX51W1微循環(huán)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

4 方法

4.1大鼠膿毒癥模型制備及分組

取SD大鼠，3%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法復(fù)制膿毒癥模型[9]，即CLP。隨機(jī)分為常規(guī)治療組、PBA早期處理組、膿毒癥組和假手術(shù)組(5mg/kg PBA)，每組8只。常規(guī)治療組：根據(jù)膿毒癥救治指南[1]，在CLP 12h后靜脈給予乳酸林格氏液(Lactate Ringer’s solution，LR)、抗生素頭孢呋辛鈉(100mg/kg)和血管活性藥物多巴胺(輸注速度10μg/kg·min)，輸注3h，使MAP>65mmHg；PBA早期處理組：在CLP手術(shù)完成后立即尾靜脈給予PBA(5mg/kg)，在CLP 12h后進(jìn)行常規(guī)治療3h；膿毒癥組：在CLP 12h后放置3h再檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)；假手術(shù)組除了不結(jié)扎盲腸和穿孔以外，其他操作與膿毒癥組一致。

4.2肺和腎血管通透性測(cè)定

大鼠麻醉后仰臥固定，頸靜脈插管，穩(wěn)定后按照9mg/kg經(jīng)頸靜脈注射FITC-BSA，待FITC-BSA循環(huán)2h后，從頸靜脈勻速注射稀肝素40mL，結(jié)扎腹主靜脈，剪斷腹主動(dòng)脈，沖洗至肺臟和腎臟變白，取左肺上葉和整個(gè)左腎，稱重，剪碎組織，勻漿，在離心力8 000g，4℃下離心10min，取上清液，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定組織的吸光度(激發(fā)波長(zhǎng)500nm，發(fā)射530nm)，同時(shí)使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定組織勻漿液的吸光度，并計(jì)算勻漿液中熒光白蛋白濃度和總蛋白濃度。以組織上清液熒光白蛋白濃度/總蛋白濃度代表肺臟和腎臟的血管通透性。

4.3腸通透性測(cè)定

采用伊文思藍(lán)法檢測(cè)大鼠小腸通透性[10]。迅速處死大鼠后，在距胃端6～7cm處取一段約6cm小腸，用磷酸緩沖液(PBS)輕輕沖洗干凈腸腔后，將小腸兩端用線栓起制成腸囊，腸囊中注射有200μL 1.5%伊文思藍(lán)，置于37℃水浴2h后，打開腸囊，生理鹽水沖洗腸腔至沖洗液澄清，然后在50℃烤箱中烘烤24h，稱取腸干重，加2mL甲酰胺溶液置于37℃ 24h，在分光光度計(jì)上檢測(cè)波長(zhǎng)655nm的吸光度，計(jì)算出每克腸干重所含伊文思藍(lán)含量(mg/g)。

4.4腸系膜微血管通透性檢測(cè)

沿腹直線作2～3cm切口，輕輕提出小腸(距回盲部10～15cm)，并將小腸展開放在觀察板上，連續(xù)滴加37℃生理鹽水保持小腸的溫度和濕度，用配有37℃恒溫裝置的生物顯微鏡(OLYMPUS，BX51W1)進(jìn)行觀察；選擇直徑30～50 μm、200μm長(zhǎng)且無分支、無明顯彎曲的腸系膜微靜脈，通過連接在顯微鏡上的CCD彩色攝像機(jī)(OLYMPUS，DP21)在顯示屏上觀察，記錄尾靜脈注射FITC-BSA (9mg/kg)1、3、6min和12min后微血管的通透性變化。

4.5閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens-1，ZO-1)的測(cè)定方法

取血管內(nèi)皮細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，然后接種至激光共聚焦培養(yǎng)皿，細(xì)胞長(zhǎng)至80%密度時(shí)使用4%多聚甲醛固定15min，用PBS在搖床上洗(5min×3次)；0.1% Triton破膜1min，PBS洗(5min×3次)；1%牛血清白蛋白(BSA)封閉10min，PBS洗(5min×3次)；加一抗(1∶200)，4°C過夜，PBS洗(5min×3次)；二抗室溫避光孵育1h，PBS洗(5min×3次)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)避光孵育10min，PBS洗(5min×3次)，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。

4.6單層內(nèi)皮細(xì)胞熒光白蛋白透過率測(cè)定

接種內(nèi)皮細(xì)胞于Transwell中，培養(yǎng)到細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，Transwell上腔中加入20μL FITC-BSA，混勻后于10、20、40、80min和120min分別從下腔取出200μL 培養(yǎng)基于96孔板中測(cè)定熒光值，以所測(cè)出96孔板中的熒光值/20μL FITC-BSA總的熒光量反映透過率。

4.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

1 PBA對(duì)膿毒癥大鼠平均動(dòng)脈壓的影響

假手術(shù)組大鼠的平均動(dòng)脈壓為(112.0±5.3)mmHg，膿毒癥組為(62.0±7.1)mmHg，與假手術(shù)組比較，降低了44.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；常規(guī)治療組可將平均動(dòng)脈壓維持在(80.0±10.2)mmHg左右，與膿毒癥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；PBA早期處理后，大鼠的平均動(dòng)脈壓可恢復(fù)到正常的87.0%，與常規(guī)治療組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。見圖1。

圖1各組大鼠平均動(dòng)脈壓的變化。sham：假手術(shù)組；sep：膿毒癥組；CT：常規(guī)治療組；PBA：PBA早期處理組(5mg/kg)。與假手術(shù)組比較：*P<0.01；#與膿毒癥組比較，P<0.05；與CT組比較：ΔP<0.01

2 PBA對(duì)膿毒癥大鼠腸系膜微血管通透性和腸屏障功能的影響

為觀察PBA對(duì)膿毒癥大鼠腸屏障功能的保護(hù)作用，分別采用腸腔用伊文思藍(lán)法測(cè)定腸組織的通透性和CLP12h后直接注射FITC-BSA，觀察腸微血管的通透性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組腸系膜微靜脈在FITC-BSA作用12min無明顯差異；膿毒癥組的腸系膜微靜脈從注入FITC-BSA 1min后開始從血管往組織滲漏，并且隨著FITC-BSA作用時(shí)間延長(zhǎng)，滲漏到組織間隙越多，到FITC-BSA作用12min時(shí)，整個(gè)視野都散布著FITC-BSA；PBA早期處理組隨著FITC-BSA作用時(shí)間延長(zhǎng)，也有部分滲漏，但是滲漏到組織間隙的FITC-BSA顯著少于膿毒癥組(圖2)。伊文思藍(lán)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：膿毒癥組大鼠的腸組織明顯滲漏，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；常規(guī)治療后腸道的通透性有部分改善(P=0.010)；PBA早期處理可明顯降低腸道的通透性，與常規(guī)治療組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖3。

圖2PBA早期處理對(duì)膿毒癥大鼠腸系膜微血管通透性的影響

圖3 腸組織通透性。sham：假手術(shù)組；sep：膿毒癥組；CT：常規(guī)治療組；PBA：PBA早期處理組(5mg/kg)；1、3、6min和12min是FITC-BSA注射后的時(shí)間；與假手術(shù)組比較：*P<0.01；與CT組比較：#P<0.01

3 PBA對(duì)膿毒癥大鼠肺臟和腎臟血管通透性的影響

膿毒癥后，大鼠的肺臟和腎臟血管滲漏顯著增加，與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；常規(guī)治療后肺臟和腎臟血管通透性有部分改善(P=0.005)；PBA早期處理可顯著降低肺臟和腎臟血管的通透性，與常規(guī)治療組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。見圖4。

圖4 PBA早期處理對(duì)膿毒癥大鼠通透性的影響。a.肺臟通透性；b.腎臟通透性；sham：假手術(shù)組；sep：膿毒癥組；CT：常規(guī)治療組；PBA：PBA早期處理組(5mg/kg)。與假手術(shù)組比較：*P<0.01；與CT組比較：#P<0.05

4 PBA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1的影響

為了進(jìn)一步觀察PBA對(duì)通透性的調(diào)節(jié)作用，取原代內(nèi)皮細(xì)胞，用LPS刺激，測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1連接緊密，結(jié)構(gòu)完整；LPS(2μg/mL)刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間的緊密連接被破壞，呈斷斷續(xù)續(xù)分布，細(xì)胞間隙增大，ZO-1表達(dá)降低，PBA早期處理后內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)明顯改善，ZO-1表達(dá)增加，形態(tài)較為連續(xù)清晰。見圖5。

圖5 PBA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1的影響。N：正常對(duì)照組；LPS：2μg/mL LPS處理細(xì)胞24h；LPS+PBA：PBA(5μmol/L)作用4h后，給予LPS作用24h；ZO-1：內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白；DAPI：細(xì)胞核染料；Merge：ZO-1和DAPI合并圖

5 PBA對(duì)單層內(nèi)皮細(xì)胞熒光白蛋白透過率和TER的影響

與正常對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞比較，LPS刺激能顯著增加熒光白蛋白透過率，增加了96.1%(P<0.001)；PBA早期處理可顯著降低LPS刺激引起的熒光白蛋白透過率的升高，與LPS組相比，降低了24.8%(P=0.014)。LPS組的TER隨著LPS刺激時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；PBA早期處理內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞的TER逐漸升高，與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 PBA早期處理對(duì)單層內(nèi)皮細(xì)胞熒光白蛋白透過率的影響。N：正常對(duì)照組；LPS：2μg/mL LPS處理細(xì)胞24h；LPS+PBA：PBA(5μmol/L)作用4h后，給予LPS作用24h；Normalized Resistance：標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞跨膜電阻。與正常對(duì)照組比較，*P<0.01；與LPS組比較，?P<0.05

討 論

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其發(fā)病率高，病死率高，是ICU病死率最高的疾病之一[11]。血管滲漏是膿毒癥患者多器官功能障礙的主要原因。盡管關(guān)于膿毒癥血管滲漏的研究較多，但由于機(jī)制復(fù)雜，無針對(duì)性的治療措施，因此尋找有效的治療藥物對(duì)膿毒癥血管滲漏具有重要的意義。

PBA是美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市的新藥，由于其廣泛的藥理特性，在多種疾病中發(fā)揮著保護(hù)作用。如在利用自體血腦內(nèi)立體定向注射法建立大鼠腦出血模型中，不同劑量的PBA能明顯改善腦水腫和血腦屏障的完整性[12]；在逆行胰膽管注射5%?；悄懰徕c溶液建立的大鼠SAP肝損傷模型中，PBA可以明顯改善大鼠血清淀粉酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及谷草轉(zhuǎn)氨酶的含量，可以改善胰腺病理學(xué)評(píng)分和肝臟病理學(xué)評(píng)級(jí)[13]；在原代皮層神經(jīng)元構(gòu)建的氧糖剝奪/再灌注(OGD/R)損傷模型中，PBA顯著改善OGD/R所導(dǎo)致的神經(jīng)元存活率下降和細(xì)胞凋亡增加[14]，但PBA對(duì)膿毒血癥所致血管通透性增加是否有作用，目前尚未明確。本研究采用CLP復(fù)制膿毒癥模型,結(jié)果顯示，PBA早期處理可明顯降低重要臟器血管和腸道通透性，可以增加內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接并增加內(nèi)皮細(xì)胞TER。提示PBA早期處理對(duì)膿毒癥大鼠的血管通透性有保護(hù)作用。

PBA通過什么分子機(jī)制發(fā)揮對(duì)膿毒癥大鼠通透性的保護(hù)作用呢？目前研究比較多的是PBA作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑，發(fā)揮分子伴侶活性的作用，協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾和折疊，從而減輕ERS所致的損傷[15-16]。筆者以往的研究證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在膿毒性休克血管通透性增高起重要作用，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑牛磺酸可以改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及血管通透性[17]。此外，PBA除了對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有作用外，越來越多的文獻(xiàn)顯示其對(duì)其他信號(hào)通路也有作用，如Jian等[18]的研究顯示PBA可通過抑制氧化應(yīng)激損傷而發(fā)揮對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，在膿毒癥中PBA是否也通過這些通路發(fā)揮作用有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示PBA早期處理對(duì)膿毒癥大鼠的血管通透性有保護(hù)作用，為膿毒癥的治療提供新的策略，為PBA的臨床應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)。