新型環(huán)烯烴聚合物微流控芯片的設(shè)計(jì)及其在大腸埃希菌O157：H7 快速檢測中的應(yīng)用

高菊逸，吳傳安，楊偉康，羅裕旋，劉勝楠，徐小平

（1.深圳市龍華區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518110；2.香港大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518053）

大腸埃希菌O157：H7是大腸埃希菌中可引起人類發(fā)病最多的血清型之一，可從牛肉或牛奶等食物中被分離到，主要引起人的出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征，病死率較高[1-4]。因此，該菌在食品安全等方面具有重要的研究價(jià)值。本研究利用微流控芯片技術(shù)建立了一種快速檢測大腸埃希菌O157：H7的技術(shù)平臺(tái)，具有耗材成本低、操作簡便、檢測時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 微流控芯片設(shè)計(jì)及制作

取25μmOCA光學(xué)透明膠，利用計(jì)算機(jī)輔助軟件（Pro/Engineer）設(shè)計(jì)的長160 μm、寬40 μm的流體通道，采用激光雕刻技術(shù)切出設(shè)計(jì)圖形（圖1）。將合適尺寸的環(huán)烯烴聚合物（cycloolefin polymer，COP）與OCA光學(xué)透明膠一同放入O2等離子進(jìn)行清洗（100 mW，1% O2，60 s）后取出，用OCA光學(xué)透明膠將上、下2層COP進(jìn)行不可逆鍵合，放入80 ℃烤箱烘烤10 min。芯片制作完成后，將可食用性染料通入芯片，用于驗(yàn)證芯片的實(shí)用性（圖2）。

圖1 微流控芯片設(shè)計(jì)圖

圖2 微流控芯片實(shí)物圖

1.2 芯片檢測區(qū)域表面修飾和抗體固定

通過注射泵控制反應(yīng)通道內(nèi)反應(yīng)液的流動(dòng)，采用巰基-馬來酰亞胺基團(tuán)硅烷化偶聯(lián)法，對(duì)反應(yīng)檢測區(qū)進(jìn)行表面修飾和抗體固定[5-7]。具體步驟為：用注射泵往通道中通入5 μL 3-巰基丙基三甲氧基硅烷（3-methyl propyl trimethoxy silane，MPTS）（5%，溶于無水乙醇溶液），5 μL N-（4-馬來酰亞胺丁?；酰╃牾啺罚?-maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester，GMBS）

（2 mg/mL，溶于二甲亞砜溶液），分別在室溫下反應(yīng)1 h和30 min，反應(yīng)后用無水乙醇和磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗。清洗后，通入5 μL鏈霉親和素溶液（1 mg/mL，溶于PBS），室溫下反應(yīng)1 h。PBS清洗后，通入5 μL生物素標(biāo)記羊抗O157：H7大腸埃希菌菌體抗原抗體（單抗，美國KPL公司）（10 μg/mL，溶于含1%牛血清白蛋白的PBS）（圖3），室溫下反應(yīng)30 min后沖洗備用。

圖3 芯片內(nèi)表面修飾

1.3 菌株來源及樣本制備

1.3.1 菌株來源 大腸埃希菌O157：H7菌株（深圳市疾病預(yù)防控制中心），大腸埃希菌（ATCC 25922）、傷寒沙門菌（ATCC 14028）（香港大學(xué)深圳醫(yī)院微生物科），大腸埃希菌O157：H7顯色培養(yǎng)基（法國科瑪嘉公司），EC肉湯培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱公司）。

1.3.2 樣本制備 取接種了大腸埃希菌O157：H7并過夜培養(yǎng)后的營養(yǎng)肉湯菌懸液0.2 mL，加入無菌0.9%氯化鈉溶液，調(diào)成濃度為1.6×107CFU/mL的初始菌液（經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)確定濃度），10倍稀釋至1.6×101CFU/mL，每個(gè)濃度各取1 mL菌液于沸水中煮15 min滅活，離心備用。大腸埃希菌（ATCC 25922）和傷寒沙門菌（ATCC 14028）也分別按上述方法進(jìn)行培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，制成1×107CFU/mL的菌懸液，離心備用。陰性對(duì)照為高壓滅菌的PBS緩沖液，陽性對(duì)照（自制）為經(jīng)熒光染料V3染色的大腸埃希菌O157：H7菌液（濃度為1×106CFU/mL）。

1.4 確定最佳進(jìn)樣流速和進(jìn)樣時(shí)間

采用注射泵分別以0.5、1.0、3.0、5.0 μL/min的速度往芯片內(nèi)通入陽性對(duì)照液，每隔5 min記錄1次熒光信號(hào)值，直至60 min。當(dāng)進(jìn)樣速度為0.5 μL/min時(shí)，芯片反應(yīng)區(qū)內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度可達(dá)到最高，到達(dá)最高值需要1 h；當(dāng)進(jìn)樣速度為1.0 μL/min時(shí)，芯片反應(yīng)區(qū)內(nèi)的最高熒光信號(hào)強(qiáng)度比0.5 μL/min時(shí)略低，達(dá)到最高值需要30 min；隨著進(jìn)樣速度的加快，反應(yīng)區(qū)內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最高值的時(shí)間也逐漸縮短，但熒光信號(hào)最高值也逐漸下降。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇1.0 μL/min和30 min為最佳進(jìn)樣速度和反應(yīng)時(shí)間。見圖4。

圖4 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

1.5 樣本的檢測

采用注射泵將待測樣本及陰、陽性對(duì)照液各30 μL以最佳進(jìn)樣速度從通道通入芯片內(nèi)。反應(yīng)30 min后，以PBS沖洗，再以最佳進(jìn)樣速度從通道通入5 μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊抗大腸埃希菌O157：H7菌體抗原單克隆抗體（50 μg/mL，溶于含1%牛血清白蛋白的PBS）。反應(yīng)30 min并沖洗后，將芯片置于倒置熒光顯微鏡下觀察檢測區(qū)域內(nèi)的熒光，并用電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）拍照記錄（20倍，曝光時(shí)間1.25 s），最后用Image-Pro Plus 5.0軟件分析各檢測區(qū)域的熒光信號(hào)。熒光信號(hào)強(qiáng)度高于陰性對(duì)照熒光值+3s者為陽性，反之為陰性[8]，其中陰性對(duì)照熒光值為465～495。

1.6 確定檢測靈敏度和特異性

分別取1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL的大腸埃希菌O157：H7菌液，并以0.9%氯化鈉溶液做陰性對(duì)照，以最佳進(jìn)樣速度通入芯片內(nèi)進(jìn)行檢測，采用SPSS 13.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果確定新型微流控芯片的最低檢測限，即靈敏度。

分別取1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL的大腸埃希菌（ATCC 25922）及傷寒沙門菌（ATCC 14028）菌液進(jìn)行檢測，觀察檢測結(jié)果，確定特異性。

2 結(jié)果

2.1 新型COP微流控芯片的優(yōu)勢

本研究采用激光雕刻機(jī)為加工儀器、以O(shè)CA光學(xué)透明膠為主要材料制作的微流控芯片，與采用光刻機(jī)制作的微流控芯片相比，具有制作過程簡單、制作速度快、成本低、環(huán)保、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。芯片的制作只需1 min即可完成，而且采用的儀器價(jià)格低廉、便于攜帶，對(duì)試驗(yàn)環(huán)境、人員要求低，適合院外或床旁檢測。臨床上傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測一般需要48～72 h，而這種新型的技術(shù)只需30 min～1 h即可完成檢測，樣本和試劑用量少、不需大型設(shè)備、費(fèi)用低廉。

2.2 檢測限

分別檢測大腸埃希菌O157：H7菌液和對(duì)照液，每個(gè)濃度平行測定3次。微流控芯片檢測區(qū)域內(nèi)的熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著大腸埃希菌O157：H7菌液濃度的遞增而逐漸增強(qiáng)，形成1個(gè)S形曲線，而陰性對(duì)照組熒光信號(hào)強(qiáng)度保持在極低的水平。以細(xì)菌濃度對(duì)數(shù)值（CFU/mL）為橫坐標(biāo)，以熒光信號(hào)對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，得到濃度反應(yīng)曲線。根據(jù)最低檢測限為熒光信號(hào)強(qiáng)度高于陰性對(duì)照熒光值+3s者的樣本濃度[9]，確定本方法對(duì)大腸埃希菌O157：H7的檢測限為1×103CFU/mL。見圖5。

2.3 特異性

取濃度為1×107CFU/mL 的大腸埃希菌O157：H7、大腸埃希菌（ATCC 25922）和傷寒沙門菌（ATCC 14028）菌液各30 μL，每個(gè)樣本平行測定3次。在通入相同濃度的菌液后，大腸埃希菌O157：H7的熒光信號(hào)強(qiáng)度比通入大腸埃希菌（ATCC 25922）及傷寒沙門菌（ATCC 14028）的熒光信號(hào)強(qiáng)度高出3個(gè)數(shù)量級(jí)，熒光信號(hào)對(duì)數(shù)值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.324，P＜0.01），表明此方法對(duì)大腸埃希菌O157：H7的檢測具有很高的特異性。見圖5。

圖5 微流控芯片檢測大腸埃希菌O157：H7的靈敏度和特異性

2.4 可重復(fù)性

取濃度為1×106CFU/mL的大腸埃希菌O157：H7菌液，分為10份，按上述方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，同批檢測的精密度（以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示）為5.2%，表明此方法具有較好的可重復(fù)性。

2.5 模擬臨床樣本的檢測

取100份正常人臨床糞便樣本，挑取少量樣本制成糞便懸液樣本，加入已知濃度的大腸埃希菌O157：H7，配置成含不同濃度大腸埃希菌O157：H7（1×103～1×106CFU/mL）的陽性樣本50份，及不含大腸埃希菌O157：H7的陰性樣本50份。700×g離心15 s后用紗布過濾，每份樣本都同時(shí)以微流控芯片法和培養(yǎng)法進(jìn)行檢測，最后計(jì)算出微流控芯片法的敏感性、特異性及2種方法的符合率。培養(yǎng)法參照《全國腸出血性大腸埃希菌O157：H7感染性腹瀉監(jiān)測方案》[10]進(jìn)行檢測和鑒定。結(jié)果顯示，微流控芯片法檢測糞便樣本中大腸埃希菌O157：H7的敏感性為90%，特異性為100%，二者符合率達(dá)95%。見表1。

表1 2種方法檢測結(jié)果比較 份

3 討論

微流控芯片技術(shù)是目前生物化學(xué)、藥物、化學(xué)合成及臨床診斷等領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容。但隨著研究的不斷深入，微流控芯片技術(shù)的發(fā)展也逐漸暴露出一些問題，如系統(tǒng)操作復(fù)雜、相關(guān)研究力量薄弱、對(duì)技術(shù)人員要求高、制作工藝局限性大等。為了實(shí)現(xiàn)技術(shù)上的突破，本研究團(tuán)隊(duì)前期研究通過雙面黏性薄膜微流控芯片實(shí)現(xiàn)了對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲，對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞的捕獲率為（92±3）%，證明這種材料制作的微流控芯片在實(shí)際應(yīng)用中是可行的，可大大降低人力和物力成本。本研究采用OCA光學(xué)透明膠和COP研制的新型塑料微流控芯片，進(jìn)一步提高了材料的選用標(biāo)準(zhǔn)，可在管道中增加結(jié)構(gòu)，提高芯片的檢測范圍，再結(jié)合表面修飾技術(shù)和免疫熒光技術(shù)，大大降低了技術(shù)成本，其中表面修飾固定抗體環(huán)節(jié)還利用等離子清洗等工序，使得檢測系統(tǒng)的靈敏度有了更好的保障。

本研究建立的COP微流控芯片系統(tǒng)只需30 min～1 h即可完成檢測，不需大型設(shè)備，樣本和試劑用量少，且低碳、環(huán)保，對(duì)大腸埃希菌O157：H7的檢測限為1×103CFU/mL。經(jīng)模擬實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，此法檢測敏感性為90%，特異性為100%，與李永新等[11]采用微流控芯片-激光誘導(dǎo)熒光快速檢測大腸埃希菌O157：H7的檢測限相近，但本研究的芯片制作過程簡單、速度快、成本低，更適合用于院外及床旁檢測。此外，該微流控芯片不僅可用于檢測同一種病原菌，還可以采用多通道同時(shí)檢測多種病原菌，可作為疾病早期對(duì)病原菌的快速篩查方法，對(duì)臨床快速獲得病原菌信息，制定個(gè)性化治療方案具有重要意義。