Beclin1過(guò)表達(dá)對(duì)黑素瘤SK-MEL-2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

徐艷艷 王久江 張伶 韓昭 牛亮 張建忠 劉釗

李改靜 李小兵 劉晴 劉志軍 李小靜

河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，河北邯鄲 056002

皮膚惡性黑素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）侵襲性強(qiáng)，易發(fā)生血液和淋巴管轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為10.9%，黑素瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為是影響患者預(yù)后的重要因素［1-2］。Beclin1作為自噬核心復(fù)合物關(guān)鍵蛋白，被認(rèn)為是潛在的抑癌基因［3］。前期研究顯示，Beclin1蛋白可能抑制黑素瘤瘤體生長(zhǎng)［4-6］，蘇遠(yuǎn)婷等［7］發(fā)現(xiàn)，黑素瘤組織Beclin1蛋白表達(dá)低于黑素瘤周邊的正常表皮細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中我們以上調(diào)Beclin1表達(dá)水平為切入點(diǎn)，在細(xì)胞水平上進(jìn)一步探討B(tài)eclin1對(duì)黑素瘤的影響，以期對(duì)開(kāi)發(fā)針對(duì)惡性黑素瘤的靶向藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、主要材料

人黑素瘤細(xì)胞株A375、SK-MEL-2來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。Beclin1抗體產(chǎn)自英國(guó)Abcam公司；羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶產(chǎn)自美國(guó)Abbkille公司；全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠配制試劑盒均為上海碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染所用質(zhì)粒pcDNA.3.1/myc-His（-）A、pcDNA3.1-Beclin1質(zhì)粒均由中國(guó)凱基生物有限公司構(gòu)建并測(cè)序，Beclin1基因編號(hào)為AF139131.1；轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；Transwell小室為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品；CCK8試劑盒為日本Dojindo Laboratories公司產(chǎn)品。

二、方法

1.細(xì)胞準(zhǔn)備：取出凍存的人黑素瘤細(xì)胞株A375、SK-MEL-2復(fù)蘇，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)和傳代，培養(yǎng)至2代以上消化吹打混勻成細(xì)胞懸液。

2.Western印跡篩選低表達(dá)Beclin1的黑素瘤細(xì)胞株：取上述細(xì)胞懸液離心后棄上清液，37℃消化。取細(xì)胞懸液洗滌后裂解細(xì)胞，離心15 min，取上清液用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。取上清液與上樣緩沖液混合后100℃水浴5 min，室溫冷卻，每孔取60 μg樣品上樣，電泳，轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，封閉1 h。以3-磷酸-甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，加入一抗（稀釋比例1∶2 000）孵育Beclin1過(guò)夜，加入羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶二抗（稀釋比例1∶6 000）孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光和與X線片定影。使用Gel-Pro32軟件對(duì)條帶灰度值以Beclin1與GAPDH灰度值比值表示Beclin1的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及鑒定：取SK-MEL-2細(xì)胞懸液培養(yǎng)至密度達(dá)到50%～70%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為3組，空白組不做處理，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA.3.1/myc-His（-）A，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Beclin1質(zhì)粒。將3 μg稀釋好的目的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染液等量混勻，室溫孵育5 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)48 h后，G418篩選單克隆細(xì)胞。Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞Beclin1的表達(dá)（方法同前）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制水平：將上述3組細(xì)胞培養(yǎng)2周后進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24、48、72 h；在每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，棄原培養(yǎng)液，每孔加入含有10 μl CCK8的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h，在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定每孔450 nm波長(zhǎng)下吸光度（A450值）。繪制增殖曲線，增殖率=不同時(shí)間點(diǎn)A450值/初始A450均值×100%。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

5.Tanswell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：在Transwell上室加入稀釋融化的Matrigel膠，37℃靜置2 h，將上述3組細(xì)胞饑餓培養(yǎng)24 h后消化、計(jì)數(shù)。向小室中加入100 μl細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為1×104/室，將小室置入含有500 μl/孔完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h；拭去基質(zhì)膠和小室內(nèi)細(xì)胞，對(duì)小室底部細(xì)胞予用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗滌3次，200倍顯微鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：取上述3組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化接種至6孔板培養(yǎng)12 h，細(xì)胞匯合度達(dá)60%左右時(shí)，為排除細(xì)胞增殖引起的誤差，加入適量絲裂霉素培養(yǎng)1 h后換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)2 h，然后，用無(wú)菌槍頭垂直在6孔板中均勻劃線，PBS洗去漂浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、24、48 h后拍照，測(cè)量細(xì)胞遷移距離。細(xì)胞遷移距離=0 h劃痕寬度-某時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)符合方差齊性時(shí)，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩株黑素瘤細(xì)胞Beclin1表達(dá)水平

SK-MEL-2細(xì)胞Beclin1相對(duì)表達(dá)水平為0.037±0.010，明顯低于A375細(xì)胞（0.670±0.150），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=46.62，P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

二、轉(zhuǎn)染后SK-MEL-2細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)水平

Western印跡檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，3組間Beclin1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=81.38，P＜0.05），其中，實(shí)驗(yàn)組為0.32±0.04，明顯高于空白組（0.07 ± 0.02，t=1.08，P＜0.05）和陰性對(duì)照組（0.06± 0.02，t=1.13，P＜0.05），空白組和陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.04，P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

三、轉(zhuǎn)染后SK-MEL-2細(xì)胞體外增殖能力比較

圖1 Western印跡檢測(cè)A375和SK-MEL-2細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá) Beclin1蛋白在SK-MEL-2中顯著低表達(dá)。GAPDH：3-磷酸-甘油醛脫氫酶

圖2 Western印跡檢測(cè)SK-MEL-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Beclin1蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組Beclin1蛋白表達(dá)明顯高于空白組和陰性對(duì)照組。GAPDH：3-磷酸-甘油醛脫氫酶

重復(fù)測(cè)量的方差分析顯示，空白組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=1 077.36，P＜0.05），各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=4 903.04，P＜0.05），組別和時(shí)間有交互作用（F交互=205.20，P＜0.05）。培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，3組間細(xì)胞增殖率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為1 012.89、10 227.34、13 826.12，均P＜0.05），且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率逐漸升高，實(shí)驗(yàn)組增殖率低于空白組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

四、轉(zhuǎn)染后各組SK-MEL-2細(xì)胞侵襲力比較

Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，24 h后3組間每高倍（×200）視野下穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=128.93，P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組（18.67±1.19）明顯低于陰性對(duì)照組（87.89± 6.05，t=33.53，P＜0.001）和空 白 組（86.78 ± 5.93，t=32.99，P＜0.001）。見(jiàn)圖4。

五、轉(zhuǎn)染后各組SK-MEL-2細(xì)胞遷移活性比較

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，3組間細(xì)胞遷移距離在24 h（F=45.25，P＜0.05）和48 h（F=66.66，P＜0.05）時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組在上述時(shí)間點(diǎn)均顯著低于空白組（P＜0.05）和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

討 論

Beclin1蛋白是調(diào)控自噬的關(guān)鍵標(biāo)志蛋白［7］，在各種應(yīng)激因素刺激下，Beclin1和Bcl-2蛋白分離，Beclin1蛋白的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域（ECD）與Ⅲ型PI3K中的亞基Vps34結(jié)合，誘導(dǎo)吞噬泡形成，從而啟動(dòng)自噬［8-10］。研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1不僅能啟動(dòng)自噬，Beclin1功能結(jié)構(gòu)域還能和自噬相關(guān)調(diào)節(jié)因子結(jié)合，對(duì)腫瘤產(chǎn)生抑制作用。

圖3 轉(zhuǎn)染后SK-MEL-2細(xì)胞增殖活性比較 各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率顯著低于空白組和陰性對(duì)照組。a：兩組間比較，P＜0.05

圖4 Transwell小室法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組SK-MEL-2細(xì)胞侵襲能力 實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)少于其他兩組

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組SK-MEL-2細(xì)胞遷移活性 5A：顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況；5B：細(xì)胞遷移距離統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。實(shí)驗(yàn)組24、48 h遷移能力明顯下降。a：兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05

在前期研究中［4-5］我們發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能體外誘導(dǎo)A375細(xì)胞自噬，使自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)顯著升高，同時(shí)抑制A375細(xì)胞生長(zhǎng)能力。隨后在小鼠黑素瘤動(dòng)物模型中［6］發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能使Beclin1表達(dá)上調(diào)，通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制黑素瘤瘤體生長(zhǎng)，提示在黑素瘤中Beclin1蛋白可能作為抑癌蛋白存在。本研究中，我們通過(guò)Western印跡技術(shù)篩選出Beclin1低表達(dá)的SK-MEL-2細(xì)胞株作為研究對(duì)象，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，成功構(gòu)建Beclin1過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，研究Beclin1表達(dá)上調(diào)對(duì)SK-MEL-2細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，Beclin1表達(dá)上調(diào)后SK-MEL-2細(xì)胞增殖能力明顯減弱，侵襲能力下降。但遷移距離可能受細(xì)胞增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)在劃痕實(shí)驗(yàn)前，預(yù)先將細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C處理以排除細(xì)胞增殖引起的誤差，結(jié)果表明，Beclin1表達(dá)上調(diào)后，SK-MEL-2細(xì)胞遷移能力明顯減低。Hu等［11］發(fā)現(xiàn)，Beclin1蛋白過(guò)表達(dá)可有效抑制舌上皮細(xì)胞的增殖和克隆，還發(fā)現(xiàn)Beclin1表達(dá)下降和晚期腫瘤臨床轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良顯著相關(guān)。然而有學(xué)者提出，在腫瘤化療期間，Beclin1蛋白下調(diào)可以增加化療藥物的敏感性［12］。推測(cè)這可能與自噬在調(diào)控腫瘤的作用中存在階段性有關(guān)。

已有研究證實(shí)，前列腺癌［13］、結(jié)腸癌［14］中Beclin1蛋白低表達(dá)。本課題組前期也發(fā)現(xiàn)，皮膚惡性黑素瘤組織中Beclin1蛋白表達(dá)量明顯低于色素痣組織，Beclin1可能為抑癌基因。祁璘等［15］發(fā)現(xiàn)，Beclin1蛋白在宮頸癌表達(dá)降低，并提出Beclin1的降低直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖活性。但Bealin1抑制黑素瘤進(jìn)程的具體機(jī)制尚不明確。Beclin1可依賴(lài)自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、清除受損的基因組和活性氧［16-17］、減少炎癥物質(zhì)［18］等機(jī)制來(lái)抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。Wei等［19］提出，Beclin1可有效誘導(dǎo)自噬，抑制腫瘤進(jìn)程。除了Beclin1依賴(lài)自噬發(fā)揮抑癌作用，Xu等［20］發(fā)現(xiàn)了Beclin1可不依賴(lài)自噬，直接與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ相互作用，抑制腫瘤的發(fā)生。Wu等［21］設(shè)計(jì)出能與Beclin 1卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的C端部分的碳?xì)浠衔锇邢蜃饔玫慕Y(jié)合肽，能通過(guò)促進(jìn)Beclin1自噬核心復(fù)合物之間的相互作用，以干擾其同聚體化，誘導(dǎo)自噬，說(shuō)明以Beclin 1為靶點(diǎn)調(diào)控膜介導(dǎo)的自噬和體內(nèi)運(yùn)輸可行性。

綜上所述，Beclin1過(guò)表達(dá)對(duì)SK-MEL-2細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為起抑制作用，在黑素瘤中可能起抑癌作用。由于自噬的復(fù)雜性和階段性，Beclin1、自噬和黑素瘤之間的具體作用機(jī)制還需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索。本研究選取低表達(dá)細(xì)胞株時(shí)僅測(cè)定了兩種細(xì)胞株Beclin1表達(dá)量，后續(xù)將增加細(xì)胞株數(shù)量并通過(guò)干擾Beclin1表達(dá)進(jìn)行反向驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突