合并肺間質(zhì)病變或惡性腫瘤皮肌炎患者的外周血差異基因表達(dá)分析

薛珂 權(quán)晟 趙茜 刁立誠 陳夢雅 朱雪梅 鄭捷 曹華 黎皓上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科 0005；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 0005；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腫瘤科 0005

目前把以皮肌炎（dermatomyositis，DM）典型皮損為主要表現(xiàn)、至少6個(gè)月沒有肌炎表現(xiàn)或者實(shí)驗(yàn)室檢查存在輕度異常的患者統(tǒng)稱為臨床無肌病性皮肌炎（clinical amyopathic dermatomyositis，CADM）或皮肌炎樣皮?。?］。DM/CADM病因不明，臨床表現(xiàn)呈多樣性和異質(zhì)性。CADM患者往往在疾病早期僅有皮肌炎的皮膚表現(xiàn)，而數(shù)周或數(shù)月后突然出現(xiàn)急進(jìn)型肺間質(zhì)病變（interstitial lung disease，ILD），同時(shí)伴有發(fā)熱、氣促，很快進(jìn)展為呼吸衰竭，影像學(xué)表現(xiàn)為兩肺彌漫性滲出伴毛玻璃影等間質(zhì)性改變，從出現(xiàn)皮疹到死亡平均2～6個(gè)月［2］。13%～42%的DM/CADM病例伴有腫瘤，大多為實(shí)體瘤，可能在DM/CADM確診1年或數(shù)年后出現(xiàn)，此時(shí)由于已使用大劑量糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑和嚴(yán)重的皮膚損害、肌肉癥狀，可能延誤手術(shù)時(shí)機(jī)［3-4］。因此早期診斷和治療DM/CADM及其合并癥可以改善預(yù)后，提高生存率。高通量RNA測序（RNA-Seq）技術(shù)可以在沒有某一物種完整基因組序列的情況下，準(zhǔn)確獲取特定組織在某一狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄組基因的全部信息，完整記錄該條件下基因表達(dá)水平、生物學(xué)過程的分子機(jī)制以及遺傳標(biāo)記信息等［5］。目前國內(nèi)外已有報(bào)道將RNA-seq技術(shù)用于銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、嬰兒血管瘤以及硬皮病等疾病的研究［6-9］。我們通過RNA-seq技術(shù)對合并ILD或惡性腫瘤的DM/CADM進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，研究其可能的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)為治療提供潛在靶點(diǎn)。

對象與方法

一、對象

2017年1月至2018年1月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科確診的DM/CADM患者27例，所有患者納入研究前均未接受治療或1個(gè)月內(nèi)僅接受小劑量糖皮質(zhì)激素（潑尼松劑量不超過10 mg/d）治療。其中女19例，男8例，年齡20～79（51.00±13.80）歲。按照合并癥狀分為3組，即合并ILD組10例，合并惡性腫瘤組8例，無ILD和惡性腫瘤組9例。上述患者的診斷均滿足Bohan-Peter的DM分類標(biāo)準(zhǔn)［10］或Sontheimer的CADM診斷標(biāo)準(zhǔn)［11］。ILD診斷標(biāo)準(zhǔn)：①肺功能異常，具體表現(xiàn)為限制性通氣功能障礙，彌散功能降低，CO彌散率（DLCO）＜80%時(shí)具有診斷意義；②不明原因的靜息或活動后氣促；③不明原因干咳＞3個(gè)月；④肺部聽診聞及Velcro啰音；⑤肺高分辨率CT有ILD的影像學(xué)改變。符合上述ILD診斷標(biāo)準(zhǔn)中1項(xiàng)及以上且發(fā)病時(shí)病原學(xué)檢查排除肺部感染時(shí)診斷為ILD。同時(shí)收集7例門診體檢患者作為健康對照，均無系統(tǒng)性疾病和自身免疫性疾病及其家族史，其中女4例，男3例，年齡25～70（54.00± 18.65）歲，與患者組性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.656、0.373）。本研究通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2016臨倫審第105號），所有受試者均簽署知情同意書。

二、方法

1.樣本收集：采集DM/CADM患者和健康對照者外周血2.5 ml于Paxgene RNA全血管（美國BD公司）中，保存于-80℃冰箱中直至送樣測序。

2.RNA-seq測序：保存于Paxgene RNA全血管中的全血經(jīng)檢測合格后，利用Oligo（dT）磁珠和磁分離器分離并純化mRNA。將mRNA打斷為片段，通過PCR擴(kuò)增富集得到DM/CADM患者外周血轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫，最后對構(gòu)建好的文庫進(jìn)行高通量測序。測序由武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司協(xié)助完成，通過BGI-SEQ-500平臺共檢測34個(gè)樣本。對測序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾（即質(zhì)量控制），去除原始數(shù)列中低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的短序列（reads）。采用濾過后序列中質(zhì)量值大于20或30的堿基數(shù)占總堿基的比例（Q20/Q30）來表示數(shù)據(jù)質(zhì)量，Q20和Q30越大，數(shù)據(jù)質(zhì)量越高，采用HISAT軟件將這些數(shù)據(jù)比對到參考基因序列，獲得比對率，比對率越高，則數(shù)據(jù)結(jié)果越可靠。

3.差異基因表達(dá)及GO與KEGG通路分析：對過濾后所得數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因（differential expressed genes）篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)：①差異表達(dá)倍數(shù)＞2或＜1/2，即|log2（差異倍數(shù)）|＞1；②錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate）＜0.05。進(jìn)一步對差異基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO按功能分別為分子功能、細(xì)胞組分和生物過程。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.01統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時(shí)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

通過測序，每個(gè)樣本平均產(chǎn)出21.71 Mb數(shù)據(jù)，比對基因集的平均比對率為79.83%，共檢測到18 072條基因。數(shù)據(jù)過濾后，平均每個(gè)樣本Q20達(dá)到98.56%，Q30達(dá)到91.94%。樣品比對基因組的平均比對率達(dá)94.42%。

二、DM/CADM患者差異表達(dá)基因及其功能注釋

圖1 皮肌炎/臨床無肌病性皮肌炎（DM/CADM）患者差異基因火山圖 1A：DM/CADM組與健康對照組比較，4 820條基因表達(dá)上調(diào)，137條基因表達(dá)下調(diào)；1B：合并肺間質(zhì)病變組與無肺間質(zhì)病變和惡性腫瘤組比較，272條基因表達(dá)上調(diào)，158條基因表達(dá)下調(diào)；1C：合并惡性腫瘤組與無肺間質(zhì)病變和惡性腫瘤組比較，398條基因表達(dá)上調(diào)和68條基因表達(dá)下調(diào)

DM/CADM患者與健康對照相比，差異表達(dá)的基因共4 957個(gè)，其中4 820條基因表達(dá)上調(diào)，137條基因表達(dá)下調(diào)（圖1A）。上調(diào)倍數(shù)最高的前10位基因分別為MTPN、SLC6A3、EIF3CL、HSPE1-MOB4、G0S2、C-X-C 趨化因子配體 2（CXCL2）、TBC1D3K、C-C趨化因子配體8（CCL8）、RGPD6、AREG；下調(diào)倍數(shù)最高的前10位基因分別為GAGE12B、GAGE4、STC2、GAGE2D、MAGEA6、MAGEC2、GAGE5、CSMD2、GAGE7、NPPB。通過差異表達(dá)基因的GO功能分析得到分類條目49個(gè)，其中8個(gè)（16.3%）與細(xì)胞組分相關(guān)，4個(gè)（8.2%）與分子功能相關(guān)，37個(gè)（75.5%）與生物過程相關(guān)（圖2A）。

KEGG信號通路分析顯示，與健康對照相比，DM/CADM患者具有43條顯著差異性富集通路（P＜0.05），其中前10位的通路分別為細(xì)胞周期、無翅基因（Wnt）信號通路、基底細(xì)胞癌、西羅莫司靶蛋白（mTOR）信號通路、黑素合成、RNA降解、線粒體自噬、成人T淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型感染、腫瘤中的蛋白聚糖以及轉(zhuǎn)錄因子（圖3A）。

三、合并ILD的DM/CADM患者差異表達(dá)基因及其功能注釋

合并ILD組與無ILD和惡性腫瘤組相比，差異表達(dá)的基因共430個(gè)，其中272條基因表達(dá)上調(diào)，158條基因表達(dá)下調(diào)（圖1B）。上調(diào)倍數(shù)最高的前10位基因分別為EIF3CL、CCL20、IL1A、SLC6A3、FOXD4L3、LIMS3、PTGES3L-AARSD1、ALX4、TBC1D3H、CLEC14A；下調(diào)倍數(shù)最高的前10位基因分別為 TBC1D3K、COL26A1、NPIPA7、TBC1D3F、TRIM49D2、FAM187B、POTEE、CYP26B1、TRIM64、TRIM64B。這些差異表達(dá)基因主要編碼Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)趨化因子（MCP-1）和表皮生長因子，參與轉(zhuǎn)錄和自噬。通過差異表達(dá)基因的GO功能分析得到顯著富集條目157個(gè)，其中27個(gè)（17.2%）與細(xì)胞組分相關(guān)，16個(gè)（10.2%）與分子功能相關(guān)，114個(gè)（72.6%）與生物過程相關(guān)（圖2B）。

KEGG信號通路分析顯示，與未合并ILD和惡性腫瘤組相比，合并ILD組具有41條顯著差異性富集通路（P＜0.05），前10位分別為瘧疾、沙門菌感染、白細(xì)胞介素17（IL-17）信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、細(xì)胞因子及其受體相互作用、趨化因子信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、Toll樣受體信號通路、軍團(tuán)桿菌感染和百日咳（圖3B）。

四、合并惡性腫瘤的DM/CADM患者差異表達(dá)基因及其功能注釋

合并惡性腫瘤組與無ILD和惡性腫瘤組相比，差異表達(dá)的基因共466個(gè)，其中398條基因表達(dá)上調(diào)，68條基因表達(dá)下調(diào)（圖1C）。上調(diào)倍數(shù)最高的前10位基因分別為 EIF3CL、TBC1D3H、C2CD4B、AREG、RASD2、H2AFB3、KIR2DL5B、CH25H、PALMD、GTF2H2C；下調(diào)倍數(shù)最高的前10位基因分別為TBC1D3K、CYP26B1、RIMBP3C、TRIM6-TRIM34、PCDHGA3、SYT5、WIF1、POTEE、FAM187B、SPDYE2B。通過差異表達(dá)基因的GO功能分析得到顯著富集條目117個(gè)，其中11個(gè)（9.4%）與細(xì)胞組分相關(guān)，12個(gè)（10.3%）與分子功能相關(guān)，94個(gè)（80.3%）與生物過程相關(guān)（圖2C）。

圖2 皮肌炎/臨床無肌病性皮肌炎（DM/CADM）患者差異基因基因本體論（GO）功能注釋 2A：DM/CADM患者組與健康對照組比較；2B：合并肺間質(zhì)病變的DM/CADM患者組與無肺間質(zhì)病變和惡性腫瘤的DM/CADM患者組比較；2C：合并惡性腫瘤組與無肺間質(zhì)病變和惡性腫瘤組比較

圖3 皮肌炎/臨床無肌病性皮肌炎（DM/CADM）患者差異基因京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 3A:DM/CADM患者組與健康對照組比較；3B：合并肺間質(zhì)病變組與無肺間質(zhì)病變和惡性腫瘤組比較；3C：合并惡性腫瘤組與無肺間質(zhì)病變和惡性腫瘤組比較

KEGG信號通路分析顯示，與無ILD和惡性腫瘤組相比，合并惡性腫瘤組具有顯著差異性的富集通路32條（P＜0.05），前10位分別為糖基化、趨化因子通路、抗原提呈、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、沙門菌感染、細(xì)胞因子及其受體互相作用、蛋白質(zhì)的消化與吸收（圖3C）。

討 論

DM/CADM是多種因素誘發(fā)的特發(fā)性炎癥性肌病，通常認(rèn)為感染、藥物、遺傳等因素參與其發(fā)?。?2］，但具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前研究表明［13］，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫病以及炎癥性疾病中mRNA異常表達(dá)。我們通過RNA-Seq技術(shù)研究DM/CADM患者差異表達(dá)基因及其所富集的通路，發(fā)現(xiàn)DM/CADM患者與健康對照相比差異表達(dá)基因中上調(diào)基因占絕大部分，提示多種基因的高表達(dá)可能參與疾病的發(fā)生。這些差異表達(dá)的基因主要編碼MCP-1和表皮生長因子，參與轉(zhuǎn)錄和自噬。Bilgic等［14］也曾報(bào)道，MCP-1在合并ILD的DM/CADM中顯著高表達(dá)。已知線粒體自噬與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)［15］，參與病原體的識別和降解、抗原提呈及T細(xì)胞的發(fā)育、分化等多個(gè)環(huán)節(jié)，參與多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化等自身免疫病的發(fā)病過程。自噬相關(guān)分子西羅莫司靶蛋白（mTOR）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ型、低氧誘導(dǎo)因子1α等參與皮肌炎發(fā)病的具體機(jī)制尚不明確［16］。我們發(fā)現(xiàn)，在DM/CADM患者中mTOR激活分子LAMTOR1和HIF1A mRNA顯著高表達(dá)，提示自噬可能參與DM/CADM的發(fā)病機(jī)制。DM/CADM患者中顯著上調(diào)的通路主要涉及腫瘤、感染和免疫反應(yīng)等，其中腫瘤相關(guān)通路占50%。

DM/CADM患者臨床表現(xiàn)呈多樣性、異質(zhì)性，部分患者合并ILD或者惡性腫瘤。我們分析了不同臨床表型DM/CADM患者的外周血差異基因及其所富集的通路。合并ILD的DM/CADM患者中，細(xì)菌感染、細(xì)胞因子/趨化因子等通路顯著富集，并未見腫瘤相關(guān)通路。由于難以進(jìn)行肺組織活檢，ILD的致病原尚未明確。病毒感染是誘發(fā)或加重皮肌炎的重要因素［17-18］，但至今未找到病毒感染的確切依據(jù)。多項(xiàng)研究顯示，細(xì)菌感染在紅斑狼瘡和銀屑病的發(fā)病中起重要作用［19-20］。DM患者的皮膚和肌肉組織中抗菌肽LL-37表達(dá)增加［21］，結(jié)合我們RNA-Seq結(jié)果中細(xì)菌感染富集通路顯著高表達(dá)，推測細(xì)菌很可能也是DM/CADM合并ILD的致病原，其機(jī)制需要進(jìn)一步研究。目前認(rèn)為Ⅰ型干擾素通路的活化是DM/CADM發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，多項(xiàng)研究已發(fā)現(xiàn)合并急進(jìn)型/亞急性ILD的DM/CADM患者血清存在相關(guān)抗體，易發(fā)生潰瘍性Gottron丘疹/征，死亡率高，預(yù)后差［22］。多項(xiàng)研究表明，血清IL-6、IL-18、干擾素β、CCL-2、CXCL-9和CXCL10等細(xì)胞因子和趨化因子水平與DM/CADM合并ILD嚴(yán)重程度相關(guān)［23-26］。本研究從轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)并發(fā)ILD的DM/CADM患者細(xì)菌感染和細(xì)胞因子/趨化因子通路顯著富集。

目前研究表明，腫瘤的發(fā)生與交叉免疫反應(yīng)、免疫功能紊亂、病毒感染以及遺傳因素有關(guān)［27］。我們從基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，DM/CADM患者病毒感染、免疫相關(guān)通路顯著富集。此外，Wnt信號通路及腫瘤代謝通路占顯著富集通路的大部分（50%），提示DM/CADM患者可能在基因轉(zhuǎn)錄水平即有腫瘤發(fā)生的傾向。在合并惡性腫瘤的DM/CADM患者中差異基因顯著富集于腫瘤相關(guān)糖基化、蛋白代謝以及自身免疫過程中的抗原提呈和細(xì)胞毒作用等通路，而非細(xì)菌感染通路。糖基化終產(chǎn)物結(jié)合受體即雙向調(diào)節(jié)蛋白（amphiregulin）通路對腫瘤的發(fā)生十分重要，是腫瘤微環(huán)境關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與腫瘤惡性生長、產(chǎn)生耐藥性以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等相關(guān)，扮演著促癌角色［28］。DM/CADM患者腫瘤微環(huán)境的改變可能是腫瘤發(fā)生的直接原因，而抗原提呈和自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒作用均在抗腫瘤過程中發(fā)揮重要作用［29-30］。

DM/CADM患者易合并ILD特別是急進(jìn)型ILD或惡性腫瘤，預(yù)后差，死亡率高。對DM/CADM患者早期診斷和干預(yù)治療，有助于降低死亡率，提高生存率。腫瘤、感染、免疫反應(yīng)等通路基因轉(zhuǎn)錄水平的改變可能參與DM/CADM的發(fā)病。細(xì)菌感染、細(xì)胞因子/趨化因子通路在合并ILD的DM/CADM患者中顯著富集；而糖基化、蛋白代謝以及抗原提呈和自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒作用在合并惡性腫瘤的DM/CADM患者中顯著富集。這些不同的富集通路可能為明確DM/CADM的發(fā)病機(jī)制以及為早期判斷和干預(yù)合并癥的發(fā)生提供潛在的標(biāo)志物。然而本文為DM/CADM患者基因組的初步研究，病例數(shù)較少，將來還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突