依那普利葉酸片對冠心病患者血管內(nèi)皮功能保護(hù)的作用機(jī)制

宋昆鵬，石海莉，陳珂，郭素萍

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦桥R床上常見和多發(fā)的心血管疾病之一，根據(jù)《中國心血管報(bào)告（2016）》，2015年中國城市居民和農(nóng)村居民冠心病死亡率基本相近，分別為110.67/10萬和110.91/10萬。血管內(nèi)皮損傷及功能失調(diào)是引發(fā)心血管疾病的起始事件[1]。研究表明活性氧（ROS）在內(nèi)皮損傷中的作用不容忽視。血管緊張素Ⅱ等多種細(xì)胞生長因子通過激發(fā)內(nèi)源性的ROS損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞[2]。煙酞胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）是血管內(nèi)生成ROS的主要酶體[3]，目前已知有6 個(gè)亞型[4,5]，其中在內(nèi)皮細(xì)胞中NOX4的表達(dá)顯著高于其它亞型，對血管內(nèi)皮氧化還原反應(yīng)及生理功能發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用[6]。本研究對依那普利葉酸片抑制NOX4基因介導(dǎo)p38MAPK NOX4信號通路對冠心病內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究，以期為其應(yīng)用于冠心病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物健康SPF級Wistar大鼠50只，雌雄各半，體重（140±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK-20060009。實(shí)驗(yàn)正式前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，房間溫度（25.0±2.0）℃，相對濕度（40±5）%，光照周期10～12 h，自由飲食。

1.1.2 藥物和試劑依那普利葉酸片（深圳奧薩制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20103783；規(guī)格：馬來酸依那普利5 mg、葉酸0.4 mg）；L-蛋氨酸 （新疆威士達(dá)生物工程股份有限公司）；同型半胱氨酸（Hcy）酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒、內(nèi)皮素-1（ET-1）ELISA試劑盒、非對稱二甲基精氨酸（ADMA） ELISA試劑盒（武漢華美生物工程公司），一氧化氮（NO）試劑盒，內(nèi)皮型一氧化氮合酶 （eNOS）試劑盒（南京碧云天生物公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（中國碧云天生物公司）；NOX4 多克隆一抗和辣根過氧化物酶（HRP）二抗（美國Santa Cruze 公司）；RT-PCR試劑盒（廣州東盛生物技術(shù)有限公司）。NOX4 和GAPDH引物序列均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長度（表1）。

1.1.3 主要儀器低溫高速離心機(jī)，由北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司提供；超微量分光光度計(jì)，由英國Biochrom公司提供；定量PCR儀、Western blot電泳儀和酶標(biāo)儀，由美國BIO-RAD公司提供；凝膠成像分析系統(tǒng)，由法國Vilber Lourmat公司提供；FluorChemQ蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)，由美國Alpha公司提供。

表1 引物序列和產(chǎn)物長度

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模將50只大鼠給予高脂、高蛋氨酸飼料（0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、2%膽固醇、3%L-蛋氨酸、10%豬油、87.3%基礎(chǔ)飼料），連續(xù)喂養(yǎng)6周；間隔2周腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg。造模后取5只大鼠處死，開胸取左心室心肌組織，4%多聚甲醛溶液固定后切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察到心臟肌纖維組織增生，炎細(xì)胞浸潤，心肌輕度變性，局部可見空泡樣改變，證明造模成功。正常對照大鼠采用基礎(chǔ)飼料正常喂養(yǎng)；間隔2周腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 動(dòng)物分組和治療將模型大鼠隨機(jī)分為模型對照組、依那普利葉酸片低劑量、中劑量組和高劑量組，每組各10只。依那普利葉酸片小劑量（5.4 mg/kg·d）、中劑量（10.8 mg/kg·d）組和高劑量（16.2 mg/kg·d）組分別口服給藥依那普利葉酸片，正常對照組和模型對照組大鼠口服等體積純凈水。治療周期均為8周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血清Hcy含量測定大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉后，取腹腔靜脈血1 ml，室溫下靜止至血液完全凝固后離心（3 000 r/min×10 min），采用ELISA法測定法檢測血清Hcy的含量。具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.2 血管內(nèi)膜增生的測定處死大鼠，快速分離大鼠胸主動(dòng)脈約5 cm，用冷生理鹽水沖洗干凈。取1 cm胸主動(dòng)脈常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟，鉻化，蒸餾水沖洗，蘇木精染色，水洗，Masson試劑染色，醋酸溶液浸洗，磷鉬酸分化，苯胺藍(lán)或光綠液染，醋酸溶液浸洗，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察血管內(nèi)膜厚度，采用圖像分析法計(jì)量內(nèi)膜增生情況，按組織學(xué)劃分，內(nèi)彈力膜以內(nèi)為內(nèi)膜。內(nèi)膜厚度=[（內(nèi)彈力膜周徑-管腔周徑）/2π]，以MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測量內(nèi)膜厚度。取血管壁內(nèi)膜最厚處測量，以3個(gè)不同橫截面的平均值表示該血管內(nèi)膜的厚度。

1.3.2 血管內(nèi)皮功能測定大鼠處死后分離腸系膜動(dòng)脈，采用冷生理鹽水沖洗干凈，制備10%的組織勻漿（組織與生理鹽水比例為1:9），離心（3000 r/min×10 min），吸取上清液檢測NO、eNOS、ET-1和ADMA的含量。NO采用硝酸還原酶法檢測，eNOS采用化學(xué)比色法檢測，ADMA和ET-1采用雙抗體夾心ELISA法檢測。各步操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.3 RT-PCR測定NOX4 mRNA表達(dá)取胸主動(dòng)脈2 cm，置于勻漿器勻漿，采用Trizol試劑盒提取RNA。測定各RNA樣本的吸光度（A）值，控制A260/A280在1.9～2.1，以RNA電泳檢測其完整性。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按其說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃長期保存。按照試劑盒說明書采用RT-PRC測定NOX4mRNA的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系：cDNA、上游引物和下游引物各0.5 μl，2×SYBR Green Super Mix12.5 μl，加入0.1%DEPC-H2O至20 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，50℃退火60 s，循環(huán)40次，72℃延伸10 min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，成像，分析各電泳帶的灰度值。結(jié)果以目的基因電泳帶灰度/內(nèi)參基因電泳帶灰度表示。

1.3.4 Western Blot測定NOX4 蛋白的表達(dá) 取胸主動(dòng)脈2 cm，置于勻漿器勻漿，加RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。樣品加適當(dāng)體積×5蛋白上樣緩沖液煮沸5 min、冷卻，離心后取上清，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，室溫下將轉(zhuǎn)膜置于脫色搖床上，用5%的脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗，4℃過夜；TBST漂洗3次，5 min/次；加二抗，室溫30 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上，洗3次，每次5min。加入二抗，37 ℃孵育，TBST洗滌（15 min×3）?；瘜W(xué)發(fā)光，壓片，顯影，定影，分析電泳帶的光密度值。結(jié)果以目標(biāo)蛋白電泳帶灰度值/與內(nèi)參蛋白電泳帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，方差齊性采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。方差不齊者先將數(shù)據(jù)進(jìn)行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后再作單因素方差分析和兩兩比較。P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血管內(nèi)皮功能比較模型對照組大鼠血管NO和eNOS較正常對照組顯著增加（P＜0.05），ET-1和ADMA較正常對照組顯著增加（P＜0.05）。依那普利葉酸小劑量組和模型對照組大鼠血管NO、eNOS、ET-1和ADMA差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），依那普利葉酸中劑量組大鼠血管NO和NOS較依那普利葉酸小劑量組顯著增加（P＜0.05），ET-1和ADMA較正常對照組顯著增加（P＜0.05）；依那普利葉酸大劑量組大鼠血管NO和eNOS較依那普利葉酸中劑量組顯著增加（P＜0.05），ET-1和ADMA較依那普利葉酸中劑量組顯著增加（P＜0.05）（表2）。

2.2 各組血清Hcy和血管內(nèi)膜厚度比較模型對照組大鼠血清Hcy和血管內(nèi)膜厚度較正常對照組顯著增加（P＜0.05）。依那普利葉酸小劑量組血清Hcy較模型對照組顯著減少（P＜0.05），兩組大鼠血管內(nèi)膜厚度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；依那普利葉酸中劑量組大鼠血清Hcy和血管內(nèi)膜厚度較依那普利葉酸小劑量組顯著減少（P＜0.05）；依那普利葉酸大劑量組大鼠血清Hcy和血管內(nèi)膜厚度較依那普利葉酸中劑量組顯著增加（P＜0.05）（表3）。

2.3 NOX4 mRNA和蛋白的比較模型對照組大鼠血管NOX4 mRNA和蛋白的表達(dá)較正常對照組顯著增加（P＜0.05）。依那普利葉酸小劑量組和模型對照組大鼠血管NOX4 mRNA和蛋白的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），依那普利葉酸中劑量組大鼠血管NOX4 mRNA和蛋白的表達(dá)較依那普利葉酸小劑量組顯著減少（P＜0.05），依那普利葉酸大劑量組大鼠血管NOX4mRNA和蛋白的表達(dá)較依那普利葉酸中劑量組顯著減少（P＜0.05）（表4）。

表2 各組大鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮功能指標(biāo)的比較

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞協(xié)調(diào)血管舒張因子及收縮因子共同調(diào)節(jié)血管的舒張狀態(tài)，預(yù)防血小板聚集和血栓形成，調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖等。血管內(nèi)皮損傷及炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是發(fā)生冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的病理基礎(chǔ)，貫穿于冠心病發(fā)生發(fā)展的全過程，逆轉(zhuǎn)失調(diào)的血管內(nèi)皮功能是治療心血管疾病的新趨勢[7]。馬來酸依那普利葉酸片是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑 和葉酸類藥物合劑，可同時(shí)起到控制血壓和補(bǔ)充葉酸的作用，能增加心肌供氧量，降低心臟前負(fù)荷，增加心泵出量，改善心功能[8,9]。但是關(guān)于其對冠心病內(nèi)皮功能的保護(hù)作用及作用機(jī)制鮮有報(bào)告。

表3 各組大鼠血清Hcy水平的比較

表4 各組大鼠血管NOX4 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

近年來許多研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化的早期標(biāo)志是血管內(nèi)膜增厚，表現(xiàn)為斑塊沉積和管腔狹窄。頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度與心肌梗死等心血管事件的發(fā)生密切相關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示依那普利葉酸可以抑制冠心病大鼠血管內(nèi)膜增厚（P＜0.05），并且具有劑量依賴性。血管內(nèi)皮細(xì)胞可分泌內(nèi)源性血管活性物質(zhì)如NO、ET-1等。血管舒張功能主要由NO介導(dǎo)，是血管內(nèi)皮產(chǎn)生的最主要的內(nèi)源性舒血管物質(zhì)，NO降低可引起血小板聚集、白細(xì)胞黏附、血管通透性增加，平滑肌細(xì)胞增生、移行，促使內(nèi)膜斑塊增厚、動(dòng)脈粥樣硬化形成[11,12]。內(nèi)皮素是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，ET-1是作用最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，可促進(jìn)心肌和血管收縮以及冠狀動(dòng)脈痙攣，并且ET-1增多可引起斑塊的破壞，導(dǎo)致白細(xì)胞黏附增多從而加重動(dòng)脈粥樣硬化[13,14]。本研究結(jié)果顯示依那普利葉酸可以增加冠心病大鼠血管NO和eNOS水平（P＜0.05），并且增加ET-1和ADMA水平（P＜0.05），并且具有劑量依賴性。因此，依那普利葉酸可以改善冠心病大鼠血管內(nèi)皮功能。

本研究結(jié)果顯示，依那普利葉酸可以降低冠心病大鼠血清Hcy水平（P＜0.05），并且具有劑量依賴性。因此，依那普利葉酸改善冠心病大鼠血管內(nèi)皮功能可能與降低冠心病大鼠血清Hcy水平有關(guān)。此外，本研究結(jié)果顯示，依那普利葉酸可以降低冠心病大鼠血管NOX4 mRNA和蛋白的表達(dá)（P＜0.05），并且具有劑量依賴性。因此，依那普利葉酸改善冠心病大鼠血管內(nèi)皮功能可能與抑制NOX4信號通路有關(guān)。

總之，依那普利葉酸片可以抑制冠心病大鼠血管內(nèi)膜增厚，顯著改善冠心病大鼠的血管內(nèi)皮功能，該作用可能與降低血清Hcy水平及抑制血管內(nèi)皮NOX4信號通路有關(guān)。