絡(luò)風寧2號方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心功能和心肌纖維化的影響

楊雪卿，王顯

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多數(shù)心血管疾病難以避免的結(jié)局，已成為重大的公共健康問題[1]，CHF的主要病因是長期心臟負荷過重，引起心室重塑并發(fā)心功能障礙，而心肌纖維化主要參與了心室重塑的病理過程[2]。因此，現(xiàn)階段尋找能延緩或阻止心肌纖維化及心室重構(gòu)過程的治療方法勢在必行。

CHF屬于中醫(yī)“心衰病”的范疇，中醫(yī)病機總屬本虛標實，本虛為陽氣虧虛，標實為水濕、痰濁、瘀血，故益氣溫陽、活血利水為其治療大法[3]。近年來關(guān)于應(yīng)用中醫(yī)藥治療心衰心肌纖維化的研究越來越多，大量中醫(yī)學者驗證了益氣、溫陽、活血類中藥方劑有減輕心肌纖維化、防止和延緩心室重構(gòu)，并明顯改善心功能的功效[4-6]。

北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院王顯教授提出了“絡(luò)風內(nèi)動”病機學說，認為氣虛血瘀、陽虛水泛、絡(luò)風內(nèi)動、風水相搏是心衰病新的病機概括，創(chuàng)新性的提出了“益氣溫陽、活血利水、祛風通絡(luò)”為治療心衰病的基本大法，并依法研制出了治療心衰病的協(xié)定處方-絡(luò)風寧2號方[7-13]。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)絡(luò)風寧2號方治療CHF患者取得了顯著的臨床療效，并且對CHF心肌纖維化標志物產(chǎn)生了一定的影響[14-19]。本研究進一步探討絡(luò)風寧2號方對心肌梗死（心梗）后心力衰竭（心衰）大鼠心功能和心肌纖維化進程的影響及其可能的藥理機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級12周齡健康雄性SD大鼠56只，體重為（200±20）克，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003，實驗動物使用許可證號：SYXK（冀）2011-0057，常溫飼養(yǎng)，自由飲水，用標準合成大鼠飼料飼養(yǎng)，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，大鼠籠具、飲水瓶定期清洗，消毒。

1.1.2 實驗藥物絡(luò)風寧2號方由徐長卿、防己、鹿銜草、黨參、炙黃芪、黑附子、桂枝、茯苓、炒白術(shù)、葶藶子等組成，均由北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院制劑室加工為顆粒劑?？ㄍ衅绽ㄩ_博通）：規(guī)格12.5 mg/片，國藥準字：H31022986，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑及儀器masson染液、無水乙醇、蘇木精、麗春紅（國藥集團化學試劑有限公司），NT-proBNP ELISA kit（SEA598）（北京益奧明科技有限公司）包埋機、病理切片機、組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司），正置光學顯微鏡（日本尼康生產(chǎn)），光學顯微鏡（奧林巴斯公司，型號：IX71），大鼠超聲影像系統(tǒng)（加拿大VisualSonics公司，型號：Vevo2100），大鼠超聲探頭（加拿大VisualSonics公司，型號：MS250，頻率范圍是14～24 MHz），MultiSkan FC酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司），低速離心機（北京雷勃爾離心機有限公司有限公司），漩渦混勻器（北京金北德工貿(mào)限公司）

1.2 方法

1.2.1 動物分組50只SD大鼠造模后，術(shù)后48 h內(nèi)死亡7只，存活43只。測量心電圖后剔除8只未成模的大鼠，剩余35只造模成功的大鼠，隨機分為模型組7只，卡托普利組7只，絡(luò)風寧2號方低劑量組7只，絡(luò)風寧2號方中劑量組7只，絡(luò)風寧2號方高劑量組7只。假手術(shù)組6只，造模完存活5只。后續(xù)因灌胃等意外，最終模型組6只，卡托普利組6只，絡(luò)風寧2號方低劑量組6只，絡(luò)風寧2號方中劑量組7只，絡(luò)風寧2號方高劑量組6只，假手術(shù)組5只。造模手術(shù)存活率43/50×100%=86%，造模成功率35/50×100%=70%，假手術(shù)組大鼠存活率5/6×100%=83.3%。

1.2.2 造模模型組大鼠采用左冠狀動脈前降支（LAD）結(jié)扎法[20,21]，術(shù)后進行心電圖檢測，心電圖I導聯(lián)ST段弓背向上抬高，同時肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域左室壁心肌變蒼白為結(jié)扎成功標志；假手術(shù)組大鼠只在LAD穿線打一線圈，不結(jié)扎。術(shù)后8周經(jīng)多普勒超聲心動圖檢測，以左室射血分數(shù)（LVEF）≤45%作為心衰模型成功的標志[22]。

1.2.3 給藥各組大鼠分別給藥，具體給藥方式，見表1。各組均連續(xù)灌胃4周。

表1 各組大鼠給藥方式

1.3 檢測指標

1.3.1 超聲心動圖檢測心臟結(jié)構(gòu)及心功能各組大鼠灌胃4周后進行超聲心動圖檢查，每組原始數(shù)據(jù)取連續(xù)3個心動周期的平均值，檢測指標包括同一心動周期的左室收縮末期內(nèi)徑（LVDs）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、LVEF。

1.3.2 血清學指標N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）灌胃4周后，大鼠進行麻醉，腹主動脈取血，以3000 r/min離心10 min，取上清，置于-80℃冰箱中備檢，采用ELISA法按試劑盒說明書檢測大鼠血清中NT-proBNP 水平。

1.3.3 Masson染色和膠原容積分數(shù)檢測每只大鼠選取左室中段橫截面心肌，3張組織切片進行Masson染色，每張切片在明視野400倍視野下隨機選取5個視野，采用Image-Pro-Plus6.0醫(yī)學圖像分析軟件計算心肌膠原面積，膠原組織面積占所測視野面積的百分比即為膠原容積分數(shù)（CVF）。

1.4 統(tǒng)計學分析試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差（±s）表示，先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析做多組間均數(shù)比較，方差齊時采用LSD法做多重比較，方差不齊的數(shù)據(jù)采用Games-Howell法做多重比較；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)先進行對數(shù)轉(zhuǎn)換成為符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)后，再用單因素方差分析做多組間均數(shù)比較；不能通過函數(shù)轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)法Kruskal-Wallis H檢驗進行多組比較，組間多重比較的顯著性水平采用校正的α’值（α’=0.05/兩兩比較次數(shù)）做統(tǒng)計學判斷，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況各組大鼠具體一般情況（表2）。

2.2 各組大鼠超聲心動圖檢測心臟結(jié)構(gòu)及心功能變化藥物干預(yù)4周后，大鼠左室擴大，整體心臟的收縮功能降低；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的LVDd、LVDs均升高（P＜0.05），LVEF顯著降低（P＜0.05），提示造模成功；與模型組比較，卡托普利組、絡(luò)風寧2號中劑量組和絡(luò)風寧2號高劑量組大鼠LVDd均顯著降低（P＜0.05），絡(luò)風寧2號高劑量組LVDs降低明顯（P＜0.05），其余各給藥組無顯著差異（P＞0.05）；與模型組比較，卡托普利組、絡(luò)風寧2號中劑量組和高劑量組大鼠LVEF均顯著升高（P＜0.05），絡(luò)風寧2號低劑量組LVEF雖有升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），（表3、圖1）。

2.3 血清學指標NT-proBNP藥物干預(yù)4周后檢測大鼠血清NT-ProBNP水平，結(jié)果顯示模型組較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）；卡托普利組、絡(luò)風寧2號低、中、高劑量組血清NT-ProBNP明顯低于模型組（P＜0.05）；與絡(luò)風寧2號低劑量組相比，高劑量組及中劑量組NT-ProBNP明顯降低（P＜0.05）；與絡(luò)風寧2號中劑量組相比，高劑量組NT-ProBNP明顯降低（P＜0.05），絡(luò)風寧2號高劑量組和卡托普利組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表4）。

表2 各組大鼠具體一般情況

表3 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)和心功能比較（±s）

表3 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)和心功能比較（±s）

注：LVDs：左室收縮末期內(nèi)徑；LVDd：左室舒張末期內(nèi)徑；LVEF；左室射血分數(shù)；與模型組比較，aP＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP＜0.05

項目 假手術(shù)組 模型組 卡托普利組 絡(luò)風寧2號低劑量組 絡(luò)風寧2號中劑量組 絡(luò)風寧2號高劑量組LVDd（mm） 5.81±0.78 7.27±1.83b 6.21±1.25a 6.51±1.42 6.21±1.25a 5.84±0.82a LVDs（mm） 2.84±0.83 6.06±1.24b 5.19±0.78 5.41±1.10 5.22±1.81 4.97±1.07a LVEF（%） 79.07±3.21 39.98±14.80b 51.49±14.94a 49.63±7.88 53.34±21.01a 53.95±11.59a

圖1 各組大鼠超聲心動圖

表4 各組大鼠血清NT-proBNP水平的比較（±s）

表4 各組大鼠血清NT-proBNP水平的比較（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP＜0.05；與卡托普利組比較，cP＜0.05；與絡(luò)風寧2號低劑量組比較，dP＜0.05；與絡(luò)風寧2號中劑量組比較，eP＜0.05

組別 例數(shù) NT-proBNP（pg/ml）假手術(shù)組 5 167.73±8.45模型組 6 493.56±12.60b卡托普利組 6 198.93±7.34a絡(luò)風寧2號低劑量組 6 322.37±8.07ac絡(luò)風寧2號中劑量組 7 248.05±10.13acd絡(luò)風寧2號高劑量組 6 218.45±9.15ade

2.4 Masson 染色和膠原容積分數(shù)檢測藥物干預(yù)4周后大鼠心肌Masson染色，大鼠肌紅纖維呈紅色，心肌纖維組織呈藍色，結(jié)果顯示假手術(shù)組細胞外僅有少量膠原，模型組出現(xiàn)大量膠原增生，藥物干預(yù)組大鼠心肌細胞纖維化程度均低于模型組，而絡(luò)風寧2號低劑量組與模型組相近，隨著中藥劑量的增加，膠原增生明顯減輕，且卡托普利組和絡(luò)風寧2號高劑量組膠原含量較模型組減少較明顯。

CVF結(jié)果顯示藥物干預(yù)4周后，模型組CVF明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；卡托普利組、絡(luò)風寧2號低、中、高劑量組CVF明顯低于模型組（P＜0.05）；與絡(luò)風寧2號低劑量組相比，高劑量組及中劑量組CVF明顯降低（P＜0.05）；與絡(luò)風寧2號中劑量組相比，高劑量組明顯降低（P＜0.05），絡(luò)風寧2號高劑量組和卡托普利組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表5）。

圖2 各組大鼠心肌細胞膠原纖維表達比較（masson染色，400×）

表5 各組大鼠心肌膠原容積分數(shù)的比較（±s）

表5 各組大鼠心肌膠原容積分數(shù)的比較（±s）

注：CVF：膠原容積分數(shù)；與模型組比較，aP＜0.05；與假手術(shù)組比較，bP＜0.05；與卡托普利組比較，cP＜0.05；與絡(luò)風寧2號低劑量組比較，dP＜0.05；與絡(luò)風寧2號中劑量組比較，eP＜0.05

組別 例數(shù) C V F（%）假手術(shù)組 5 5.7 3±0.2 1模型組 6 3 3.6 1±0.6 3 b卡托普利組 6 9.2 3±0.3 4 a絡(luò)風寧2號低劑量組 6 2 1.5 7±0.1 7 ac絡(luò)風寧2號中劑量組 7 1 4.0 0±0.1 3 acd絡(luò)風寧2號高劑量組 6 1 0.6 1±0.2 8 ade

3 討論

本研究通過大鼠冠狀動脈結(jié)扎法制成心梗后心衰模型，從心功能和組織病理學角度觀察絡(luò)風寧2號對心衰大鼠心功能和心肌纖維化的影響。冠狀動脈結(jié)扎法需要的實驗條件和操作技術(shù)要求比較高，且可出現(xiàn)與人類相似的心肌纖維化病理改變，因此是目前較好的研究心衰或心肌纖維化的動物模型[24]。本實驗造模后造模組大鼠均出現(xiàn)了蜷臥懶動或飲食減少或飲水減少或鼻唇紫紺或呼吸急促或鼠爪或鼠尾水腫等心衰的癥狀和體征，而假手術(shù)組大鼠無以上任何一項表現(xiàn)，進一步證明大鼠模型成功建立，可開展實驗。

超聲心動圖是臨床上評價心功能的常用客觀手段，本研究結(jié)果顯示造模8周后超聲提示LVEF≤45%證明造模成功。各給藥組LVDs、LVDd與模型組比較均明顯降低，同時LVEF也有明顯改善，提示應(yīng)用藥物治療后大鼠的心功能得到改善，其中卡托普利組、絡(luò)風寧2號高劑量組均顯示了較好的治療作用。

NT-proBNP水平可以反映出心臟舒張末期容量負荷和心功能情況，并可用于判斷心衰嚴重程度[25]。近年有研究表明它可作為心肌纖維化早期診斷和嚴重程度的評估指標[26]。本研究結(jié)果顯示模型組血清NT-proBNP均較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）說明模型組大鼠存在心衰，藥物干預(yù)組血清NT-proBNP明顯低于模型組（P＜0.01）說明卡托普利和絡(luò)風寧2號方干預(yù)后可使心衰大鼠NT-proBNP表達下降，證明卡托普利和絡(luò)風寧2號方可明顯改善心功能；組間比較說明絡(luò)風寧2號方改善大鼠心功能的作用和劑量呈正相關(guān)，且大劑量絡(luò)風寧2號方和卡托普利改善CHF大鼠心功能的作用相當。

本研究中，采用Masson染色法來觀察大鼠心肌纖維化程度，研究結(jié)果顯示除假手術(shù)組外，模型組心肌間質(zhì)膠原均明顯增多，說明有明顯的心衰心肌纖維化的改變；藥物干預(yù)組膠原增生均較模型組少，且隨著中藥劑量的增加，膠原增生明顯減輕；以卡托普利組和絡(luò)風寧2號高劑量組較模型組減少較明顯，說明卡托普利組和絡(luò)風寧2號高劑量組均能抑制大鼠膠原增生且抑制作用較強；進一步分析CVF，同樣證明了模型組大鼠心肌膠原明顯表達，出現(xiàn)心肌纖維化改變；卡托普利和絡(luò)風寧2號方的干預(yù)有效抑制了心肌纖維化的發(fā)展，組間比較則證明絡(luò)風寧2號方抑制心肌纖維化的作用同劑量正相關(guān)，且絡(luò)風寧2號高劑量組抑制心衰大鼠心肌纖維化的作用與卡托普利相比無明顯差異。

王顯教授創(chuàng)新性的提出了“絡(luò)風內(nèi)動”病機學說，前期大量的臨床與基礎(chǔ)研究己證實理論的合理性，我們將此病機理論在心衰領(lǐng)域中進行延伸，認為心衰病的治療應(yīng)在益氣溫陽、活血利水法的基礎(chǔ)上，強調(diào)使用“風藥”祛風通絡(luò)，加強利水消腫的功效。我們在益氣溫陽、活血利水常規(guī)治療心力衰竭的基礎(chǔ)上，加用徐長卿、鹿銜草、防己等風藥制成絡(luò)風寧2號方，方中附子溫通心腎之陽；桂枝溫心陽、通血脈、利水濕；茯苓、白術(shù)、砂仁、木香、陳皮、檀香、清半夏，一則理氣以消脈中之痰瘀，二則健脾以滲濕利水；黨參、黃芪、丹參益氣與活血相結(jié)合，可化瘀不傷正，使正氣復(fù)，心絡(luò)通；杏仁化痰平喘；葶藶子、澤瀉利水消腫；風藥徐長卿、鹿銜草、防己有輕揚之性，含芳香之氣，能直接作用于心脈，振奮陽氣、宣暢氣機、利水消腫、活躍氣血，方中藥物謹守病機，各司其屬，共奏益氣溫陽、活血利水、祛風通絡(luò)之效。

本研究結(jié)果表明絡(luò)風寧2號方有較好的改善心衰大鼠心功能和抗心肌纖維化的作用，且此作用在一定范圍內(nèi)同劑量呈正相關(guān)；本實驗還發(fā)現(xiàn)高劑量絡(luò)風寧2號方和卡托普利改善心肌纖維化大鼠心功能和抗MF的的作用相當，因此，我們推測絡(luò)風寧2號方可能有和卡托普利相同的作用機制而改善心衰MF進程，這也許是今后深入研究的方向之一。