盧萬鴻，李 鵬，王楚彪，林 彥，羅建中

國(guó)家林業(yè)和草原局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022

引 言

研究桉樹(桉屬Eucalyptus、傘房屬Corymbia和杯果木屬Angophora)控制授粉后目標(biāo)性狀的基因作用方式，有助于分析親本組合時(shí)的基因重組規(guī)律，為開發(fā)優(yōu)良雜交組合的親本選配提供理論支撐。常規(guī)的數(shù)量標(biāo)記分析精度往往不高[1-2]，而分子生物學(xué)方法[3-4]又需要強(qiáng)的專業(yè)知識(shí)，且程序繁復(fù)，很難滿足林木育種改良研究中對(duì)大量群體材料的快速分析。

化學(xué)計(jì)量學(xué)和光譜學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了近紅外光譜(near infrared spectroscopy, NIRs)用于植物來源分類及其物質(zhì)成分快速預(yù)測(cè)研究的繁榮。研究人員采集了傘房屬(Corymbia)桉樹純種及其雜交種葉片的NIRs信息，建立的傘房屬桉樹NIRs模型的判別準(zhǔn)確率為76%-90%[5]。采用人為混合松樹(Pinus)松針模擬雜交種，建立了純種松樹的NIRs判別模型，其判別準(zhǔn)確率也達(dá)到了90%以上[6]。傘房屬桉樹雜交子代與其親本萜烯含量的差異非常小，但NIRs對(duì)這種極微小的差異反映很敏感，能檢測(cè)到常規(guī)方法檢測(cè)不到的微小差異[7]。關(guān)于玉米自交系遺傳距離與其NIRs光譜距離間關(guān)系的研究顯示，其光譜距離與其遺傳距離間的相關(guān)性超過0.9，表明NIRs可以反映玉米自交系間的遺傳關(guān)系。Diepeveen等的研究更具體定位了影響NIRs特征的含有遺傳信息的小麥染色體片段[8]。

不同來源的物種在特定條件下內(nèi)在的遺傳物質(zhì)差異從根本上決定了其組織成分的差異，這是NIRs用于物種成分預(yù)測(cè)和判別分析的主要依據(jù)[9-11]。本研究以桉樹控制授粉材料為對(duì)象，分析桉樹葉片NIRs與其遺傳基礎(chǔ)間的關(guān)系，并用簇類獨(dú)立軟模式(soft independent modeling of class analog, SIMCA)和偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis, PLS-DA)兩種判別分析方法進(jìn)行桉樹雜交種及其親本的分類判別，探索NIRs用于桉樹雜交種與其親本判別的可行性及準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

試驗(yàn)材料包括粗皮桉(E.pellita)、尾葉桉(E.urophylla)、細(xì)葉桉(E.tereticonis)3個(gè)純種及其5個(gè)雜交種，雜交種分別為3個(gè)親本樹種間的雜交F1代，外加一個(gè)目前商用的桉樹無性系DH3229(見表1)。從田間試驗(yàn)林中采集各基因型的葉片用于NIRs的掃描。

表1 測(cè)試桉樹雜交組合及其親本信息Table 1 The details of the hybrids and their parents of eucalypt

1.2 儀器

手持式近紅外儀Phazir Rx (1624) (Polychromix, Thermo Scientific, USA)用于NIRs數(shù)據(jù)的采集。Phazir Rx (1624)波長(zhǎng)范圍為1 600～2 400 nm，光學(xué)分辨率12 nm，內(nèi)置基于MEMS技術(shù)的可編程微衍射光柵，自帶背景校正片。

1.3 方法

1.3.1 光譜采集

每種基因型分別選取10個(gè)單株，采集樹冠中上部的新鮮健康葉片。每單株選10片完全生理成熟的健康葉片，用Phazir Rx(1624)掃描其正面光譜共5次，以均值代表單個(gè)葉片的NIRs信息[10]。每種基因型獲得10條NIRs。

1.3.2 NIRs數(shù)據(jù)的預(yù)處理和分析

對(duì)原始NIRs進(jìn)行二階多項(xiàng)式S.G一階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理[10-11]。通過主成分分析直觀判斷NIRs對(duì)桉樹不同基因型的分類效果。建立簇類獨(dú)立軟模式(SIMCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)兩種有監(jiān)督方式的判別模型檢驗(yàn)NIRs的樹種判別效果。建立PLS-DA模型時(shí)，分別對(duì)3個(gè)親本樹種人為賦值，即1，2和3[12]。數(shù)據(jù)預(yù)處理和分析過程均在The Unscrambler x10.4(CAMO, Oslo, Norway)中實(shí)現(xiàn)，主成分分析(principal component analysis, PCA)和PLS過程均采用全交互式內(nèi)部交叉驗(yàn)證算法。

2 結(jié)果與討論

2.1 桉樹雜交種葉片的NIRs信息的差異

NIRs主要是物質(zhì)有機(jī)分子的倍頻與合頻吸收光譜，不僅能得到物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、組成和狀態(tài)信息，也能反映密度、粒度、高分子物的聚合度及纖維形態(tài)等物質(zhì)的物理狀態(tài)信息[10]。圖1是6個(gè)桉樹雜交組合原始NIRs的平均值曲線，通過NIRs原始光譜的直觀變化很難發(fā)現(xiàn)其特征峰，6種組合的NIRs信息在全波段變化趨勢(shì)基本一致，且存在明顯的重疊。在波長(zhǎng)1 860 nm之前和波長(zhǎng)1 940 nm之后，6個(gè)雜交組合的NIRs反射率在一定程度上存在差異，但不足以據(jù)此進(jìn)行樹種判別。

圖1 桉樹雜交種的原始NIRs反射率

2.2 桉樹雜交種及其親本的PCA聚類

PCA可以簡(jiǎn)化多維數(shù)據(jù)中大量重疊的信息，因子得分可以反映受試樣本間的距離關(guān)系。圖2是6個(gè)桉樹雜交種葉片NIRs數(shù)據(jù)的PCA因子得分圖。雜交種EC126，EC148和EC149能清晰地聚類[圖2上]，U6, K50和DH3229也能清晰地分開[圖2下]，表明NIRs能夠區(qū)分不同的基因型，可對(duì)遺傳差異做出響應(yīng)。

圖2 桉樹雜交子代的PCA因子得分圖

將6個(gè)雜交種同時(shí)進(jìn)行PCA分析時(shí)，各雜交種存在一定程度的重疊(未展示)，這主要與其親本的遺傳親緣關(guān)系有很大的關(guān)系。另外，因子得分的聚集度也反映了雜交種遺傳變異的大小，聚集度高的變異小，反之亦然，如圖2中EC126，K50和EC149的變異可能較大，EC148和U6的變異則相對(duì)較小。

圖3是3個(gè)親本NIRs數(shù)據(jù)PCA的因子得分圖。從圖中可以看出，粗皮桉相對(duì)較為分散，細(xì)葉桉聚集度最高，尾葉桉聚集度居中。從分類的聚集度來看，粗皮桉的變異最大，細(xì)葉桉的變異則最小?？傮w來看，因子得分圖能夠?qū)?個(gè)親本樹種清晰地分開，真實(shí)地反映了不同樹種內(nèi)在的遺傳差異。

2.3 桉樹親本模型對(duì)其雜交種的SIMCA判別

用3個(gè)親本樣本建立PCA模型，設(shè)定臨界概率水平為0.05。圖4為每組親本PCA模型對(duì)雜交子代進(jìn)行SIMCA判別的結(jié)果，結(jié)果以雜交種樣本與親本PCA模型中心間的距離表示。圖4顯示，6個(gè)雜交種均可以與其親本清晰地分開，其中雜交種K50與其母本粗皮桉的距離相對(duì)較近，EC126與其父本粗皮桉間的距離較近，EC148與其母本粗皮桉間的距離非常接近，EC149距其父本尾葉桉較近，U6基本居于其父本尾葉桉和母本細(xì)葉桉之間，商用雜交種DH3229基本居于尾葉桉和粗皮桉中間(未采集到巨桉樣本)。SIMCA模式判別中的樣本距離更直觀地反映了雜交種與其親本樣本間的遺傳相似性(遺傳距離)。

圖3 桉樹雜交親本的PCA因子得分圖

圖4 SIMCA分析中6個(gè)桉樹雜交種樣本到親本模型中心距離的Cooman圖

2.4 桉樹親本模型對(duì)其雜交種的PLS-DA判別

圖5展示了5個(gè)組合的桉樹雜交親本PLS模型對(duì)親本和雜交子代樣本的預(yù)測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示，每個(gè)親本的預(yù)測(cè)值都集中在各自響應(yīng)變量周圍(1，2和3)，且集中度很高。雜交種K50的預(yù)測(cè)值為1.5～1.7，EC126的預(yù)測(cè)值為1.1～1.2，EC148的預(yù)測(cè)值為2.1～2.3，EC149的預(yù)測(cè)值為1.2～1.5，U6的預(yù)測(cè)值為1.5～1.8。預(yù)測(cè)值顯示，EC126和EC148的預(yù)測(cè)值高度重疊，EC149預(yù)測(cè)值的變異幅度最大，K50和U6預(yù)測(cè)值的變幅居中。PLS-DA判別可以清晰地將不同基因型區(qū)分開來，不過，任何判別方法都需要專業(yè)知識(shí)來配合解讀分析結(jié)果。

圖5 PLS-DA模型對(duì)桉樹親本與其雜交種樣本響應(yīng)變量的預(yù)測(cè)

圖6是PLS-DA判別分析時(shí)所建模型第一個(gè)主因子的載荷，第二和第三個(gè)主因子的載荷分布與第一個(gè)相似，強(qiáng)度略有差異，本文沒有展示。圖中小方塊指此處波段所對(duì)應(yīng)的有機(jī)化合物的NIRs特征峰。1 890 nm處為化學(xué)鍵O—H和C—O的伸縮振動(dòng)(stretching)吸收峰，對(duì)應(yīng)的化合物主要為纖維素。1 980～2 000 nm處為O—H鍵伸縮振動(dòng)、水分子中O—H鍵變形(deformation)吸收峰[13-14]。

3 結(jié) 論

采用SIMCA和PLS-DA兩種有監(jiān)督的判別模型，有效地解決了桉樹葉片NIRs信息復(fù)雜、重疊的問題。兩種模式的判別效果均顯示，NIRs可以將桉樹雜交種、親本、雜交種與其親本清晰地區(qū)分。

結(jié)果表明NIRs真實(shí)地反映了不同基因型的遺傳信息。其次，NIRs可以反映桉樹的遺傳變異程度，即桉樹雜交F1代來自親本的加性遺傳效應(yīng)的大小。所以，NIRs能夠用于桉樹樹種的區(qū)分，也可根據(jù)PCA聚類離散度或PLS的預(yù)測(cè)響應(yīng)變量分析基因重組過程中的加性遺傳效應(yīng)。

圖6 PLS-DA判別模型第一主因子不同波段的載荷

The small square ◇ indicates NIRs characteristic peaks of the chemical bands