圓二色光譜、紅外光譜法解析羊乳和牛乳β-酪蛋白結構及性質差異

李 萌，王 娟，魏子凱，康佳欣，張 玲，Tabys Dina，劉 寧*，張 爽*

1. 乳品科學教育部重點實驗室(東北農(nóng)業(yè)大學)，黑龍江 哈爾濱 150030 2. 東北農(nóng)業(yè)大學醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150030

引 言

近年來，羊乳以營養(yǎng)價值高、低致敏性、易消化吸收等特點，深受廣大消費者的青睞。羊乳比牛乳中蛋白質、維生素及礦物質等營養(yǎng)成分的含量更高[1-2]，且現(xiàn)代醫(yī)學研究已經(jīng)證實攝入羊乳可有效改善牛乳蛋白過敏癥狀[3]。因此，為了滿足不能食用牛乳制品的特殊人群營養(yǎng)需求，尤其是患有牛乳蛋白過敏癥的嬰幼兒營養(yǎng)需求，分析羊乳和牛乳之間的差異，對研制更適合嬰幼兒的配方食品具有重要的指導意義。

羊乳和牛乳之間的差異，主要體現(xiàn)在蛋白含量及結構方面[4]。β-酪蛋白是羊乳酪蛋白中含量最多的一種蛋白(約占酪蛋白總量的54.8%)，可在消化過程中被降解成多種具有生物活性的肽段，這些生物活性肽在免疫、營養(yǎng)、消化代謝等方面發(fā)揮著重要的作用[5-6]。羊乳和牛乳β-酪蛋白結構及性質的不同，是造成羊乳和牛乳在結合鈣的能力、消化吸收能力等方面存在差異的主要原因。

目前對β-酪蛋白的研究多集中于牛乳β-酪蛋白，對羊乳β-酪蛋白結構以及羊乳和牛乳β-酪蛋白結構差異的研究還鮮有報道。因此，本研究采用圓二色光譜和紅外光譜技術測定羊乳和牛乳β-酪蛋白的結構，利用分光光度法對二者的疏基含量及溶解性進行了初步探究，旨在獲得羊乳β-酪蛋白結構及功能性質方面的信息，為今后研制出營養(yǎng)價值更高、更適合嬰幼兒的配方食品提供有利的理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料

生鮮山羊乳，采自齊齊哈爾飛鶴牧場；牛乳β-酪蛋白、尿素、Tris購于美國sigma公司；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；其余試劑均購于天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

蛋白質純化儀AKTA Exploer(美國GE公司)；LC-MS/MS Thermo Q-Exactive質譜儀(美國Thermo Scientific公司)；J-815型圓二色光譜儀(日本Jasco公司)；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司)；DU800紫外可見分光光度計(美國Beckman公司)。

1.3 方法

1.3.1 羊乳β-酪蛋白的制備

(1)羊乳β-酪蛋白的色譜分離

將羊乳樣品離心以除去脂肪，調節(jié)pH值至4.6，收集酪蛋白沉淀并凍干。取凍干后的酪蛋白沉淀600 mg，溶于30 mL的平衡緩沖液(20 mmol·L-1Tris，3 mol·L-1urea，1%β-巰基乙醇，pH 7.0)，渦旋使其充分溶解后，離心棄去沉淀。將上清液從進樣環(huán)打入AKTA Exploer蛋白質純化儀中，用0.3 mol·L-1NaCl溶液進行梯度洗脫并用自動集樣器收集各個洗脫峰。

(2)羊乳β-酪蛋白SDS-PAGE電泳和純度鑒定

將各個洗脫峰的蛋白溶液進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色液染色1 h后進行脫色，直至條帶清晰可見。用凝膠成像儀掃描獲得電泳圖片并進行分析，根據(jù)Marker的位置和各個樣品的相對分子質量確定含有β-酪蛋白的洗脫峰。

(3)羊乳β-酪蛋白的液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)鑒定

取10 μL消化后的蛋白溶液樣品進行質譜檢測。LC-MS/MS參數(shù)：液相色譜：色譜柱C18，Eprogen(5 μm，150 ?)；梯度洗脫0～60 min，100%A；0～60 min，5%～80%B；流動相A：0.1%甲酸的水溶液，B：0.1%甲酸的乙腈溶液；流速400 nL·min-1；柱溫室溫；檢測波長214 nm。質譜：正離子模式；掃描范圍50～2 200m/z；毛細管電壓1 500 V；干燥氣體溫度150 ℃。應用Proteome Discoverer 1.4軟件整合的MASCOT對UniProtKB Bovidae蛋白數(shù)據(jù)庫進行搜索、分析和鑒定。

1.3.2 圓二色光譜、紅外光譜分析羊乳和牛乳β-酪蛋白二級結構的差異

(1)圓二色光譜測定羊乳和牛乳β-酪蛋白的二級結構

取羊乳和牛乳β-酪蛋白樣品各1 mg，分別溶于2 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 mol·L-1，pH 7.0)，加入石英比色皿置于圓二色光譜儀上進行檢測，具體參數(shù)為：樣品池光徑1 mm，步長0.1 nm，掃描范圍190～250 nm，掃描速度120 nm·min-1。用Origin Pro 8.5軟件作圖，并用CD Pro軟件擬合蛋白質中二級結構的組成與含量。

(2)紅外光譜測定羊乳和牛乳β-酪蛋白的二級結構

取羊乳和牛乳β-酪蛋白樣品各1 mg，分別與10 mg溴化鉀均勻混合壓片后，置于紅外光譜儀中，在400～4 000 cm-1頻率范圍內(nèi)掃描32次。用Origin Pro 8.5軟件采集譜圖并對特征峰進行標注，用Peakfit Version 4.12軟件在相應譜帶范圍內(nèi)進行基線校正，并經(jīng)Savitsk-Golay函數(shù)平滑、去卷積處理，對二階導數(shù)曲線進行多次擬合[10]，使擬合殘差達到理想水平。根據(jù)各二級結構單元對應峰的面積，計算蛋白質中各二級結構的含量。

1.3.3 羊乳和牛乳β-酪蛋白功能性質的測定

(1)羊乳和牛乳β-酪蛋白總疏基和表面疏基含量的測定

使用Ellman’s法測定兩種蛋白的巰基含量[11]。表面巰基含量的測定：取適量兩種蛋白樣品用pH 8.0的Tris-Gly緩沖溶液(含4 mmol·L-1的EDTA)稀釋至100 mL，取5 mL稀釋液，加入0.1 mL的Ellman’s試劑。室溫避光震蕩30 min后，于10 000 r·min-1離心10 min，取上清液并用紫外分光光度計測定其在412 nm處的吸光值，以僅加Ellman’s試劑為空白對照。總巰基含量的測定與測定表面巰基含量方法一致，所使用的緩沖溶液為含4 mmol·L-1EDTA，8 mol·L-1尿素，pH為8.0的Tris-Gly緩沖溶液。

巰基(SH)含量的計算公式如下

式中：A412為樣品在412 nm處的吸光值；D為樣品稀釋倍數(shù)；c為干物質濃度，mg·mL-1。

(2)羊乳和牛乳β-酪蛋白溶解性的測定

參照Singh[12]等的方法。在室溫條件下，分別取兩種蛋白溶液樣品(10 mg·mL-1)用磁力攪拌器攪拌1 h，然后調整pH值并繼續(xù)攪拌30 min，12 000 r·min-1離心20 min。用BCA試劑盒法測定上清液的蛋白濃度，此濃度與總蛋白濃度之比即為該蛋白質的溶解度。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

2 結果與討論

2.1 羊乳β-酪蛋白的制備

2.1.1 羊乳β-酪蛋白的色譜分離純化

對酪蛋白樣品進行梯度洗脫的結果如圖1所示。從圖1可以看出，本次純化過程中出現(xiàn)一個較大的穿過峰和三個蛋白洗脫峰，將這三個蛋白洗脫峰分別標記為峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ。由于酪蛋白樣品含有的未與柱子結合的蛋白和其他雜質的洗脫液會先從柱子流出，因此層析圖中首先出現(xiàn)了一個較大的穿過峰。另外，圖1中三個蛋白洗脫峰沒有發(fā)生重合，說明酪蛋白分離效果較好，且與峰Ⅰ和峰Ⅲ相比，峰Ⅱ的峰型較大，說明其所代表的蛋白質所占比例較高。

圖1 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析法純化羊乳β-酪蛋白結果

Fig.1Purificationofgoatmilkβ-caseinbyDEAE-SepharoseFastFlowanionexchangechromatography

2.1.2 羊乳β-酪蛋白SDS-PAGE電泳和純度鑒定

圖2為各峰洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后的結果。從圖2可以看出，峰Ⅰ和峰Ⅱ均為單一的蛋白質，但峰Ⅱ相對百分含量較大，其純度高達90%。根據(jù)SDS-PAGE圖譜及β-酪蛋白的相對分子質量，可初步判定峰Ⅱ為β-酪蛋白的目標峰。

圖2 羊乳β-酪蛋白SDS-PAGE電泳結果

2.1.3 羊乳β-酪蛋白的LC-MS/MS鑒定

對峰Ⅱ蛋白組分進行LC-MS/MS鑒定，結果顯示在UniProtKB Bovidae數(shù)據(jù)庫中編號為Q95L76的蛋白得分最高，為15 678分，且該蛋白檢測出可信度較高(Score>11)的肽段共11條，這11條肽段的信息匹配表如表1所示。圖3標紅部分為該蛋白肽段及碎片離子質量數(shù)實測值與理論值相符的肽段序列，序列覆蓋率為53%。因此，根據(jù)SDS-PAGE電泳及質譜鑒定結果，可以確認本研究純化所得的峰Ⅱ蛋白組分為羊乳β-酪蛋白。

表1 LC-MS/MS測定羊乳β-酪蛋白的肽段信息匹配表Table 1 Peptides matching table of goat milk β-casein by LC-MS/MS

2.2 圓二色光譜、紅外光譜分析羊乳和牛乳β-酪蛋白二級結構的差異

2.2.1 圓二色光譜測定羊乳和牛乳β-酪蛋白的二級結構

圖4為羊乳和牛乳β-酪蛋白的圓二色光譜譜圖。根據(jù)圖4和相關參考文獻對蛋白質圓二色光譜的峰譜指認信息[13]，羊乳和牛乳β-酪蛋白在190 nm左右均出現(xiàn)一個較為明顯的正峰譜帶，此處特征峰為α-螺旋在192 nm與β-折疊在185～200 nm處特征峰的重合峰，說明這兩種蛋白結構中均含有α-螺旋和β-折疊。另外，在200～210 nm之間出現(xiàn)一個明顯的負峰譜帶，此處特征峰為α-螺旋在208 nm與無規(guī)卷曲在200 nm處特征峰的重合峰，而當波長超過206 nm后，兩種蛋白樣品的峰譜譜帶均開始向正峰發(fā)展，這是β-轉角在206 nm特征峰的譜帶所造成的結果，說明這兩種蛋白結構中還存在著大量的β-轉角和無規(guī)卷曲。使用CD pro軟件分析兩種蛋白各二級結構的相對百分含量，結果如表2所示。

圖3 羊乳β-酪蛋白的質譜序列覆蓋情況

圖4 羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白圓二色光譜圖

表2圓二色光譜測定羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白中各二級結構的百分含量

Table2Percentageofsecondarystructureingoatmilkβ-caseinandbovinemilkβ-caseinbyCirculardichroism

羊乳β-酪蛋白/%牛乳β-酪蛋白/%α-螺旋2.7±0.21a4.3±0.13bβ-折疊15.3±0.08a19.5±0.12bβ-轉角31.8±0.11a32.4±0.09a無規(guī)卷曲50.2±0.16a43.8±0.14b

注：同列肩標字母不同表示差異顯著(p<0.05)

Note: Difference letters above same column indicate significant difference (p<0.05)

根據(jù)表2可以看出，羊乳β-酪蛋白內(nèi)部α-螺旋、β-折疊含量顯著低于牛乳β-酪蛋白(p<0.05)，無規(guī)卷曲含量則顯著高于牛乳β-酪蛋白(p<0.05)。據(jù)報道，蛋白質分子中α-螺旋和β-折疊能夠形成緊密的無空腔結構，而與α-螺旋和β-折疊結構相比，無規(guī)卷曲結構的構象穩(wěn)定性和緊密程度則相對較差[14]，因此，羊乳β-酪蛋白中較低含量的α-螺旋和β-折疊以及較高含量的無規(guī)卷曲結構使其分子的無序性更高，結構更加疏松開放。

2.2.2 紅外光譜測定羊乳和牛乳β-酪蛋白的二級結構

圖5 羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白紅外光譜圖

Fig.5Fouriertransformationinfraredspectroscopyspectraofgoatmilkβ-caseinandbovinemilkβ-casein

表3紅外光譜測定羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白中各二級結構的百分含量

Table3Percentageofsecondarystructureingoatmilkβ-caseinandbovinemilkβ-caseinbyFouriertransformationinfraredspectroscopy

羊乳β-酪蛋白/%牛乳β-酪蛋白/%α-螺旋12.1±0.14a31.2±0.22bβ-折疊18.9±0.18a28.3±0.13bβ-轉角7.8±0.09a8.6±0.11a無規(guī)卷曲52.7±0.16a34.6±0.15b

注：同列肩標字母不同表示差異顯著(p<0.05)

Note: Difference letters above same column indicate significant difference (p<0.05)

圖6 羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白酰胺Ⅰ帶高斯曲線擬合圖(a)：羊乳β-酪蛋白酰胺Ⅰ帶高斯曲線擬合圖；(b): 牛乳β-酪蛋白酰胺Ⅰ帶高斯曲線擬合圖

Fig.6GaussiancurvefittingmapofamideⅠbandsofgoatmilkβ-caseinandbovinemilkβ-casein

(a): Gaussian curve fitting map of goat milk β-casein amide Ⅰ band; (b): Gaussian curve fitting map of bovine milk β-casein amide Ⅰ band

2.3 羊乳和牛乳β-酪蛋白功能性質的測定

2.3.1 羊乳和牛乳β-酪蛋白總疏基和表面疏基含量的測定

表4為羊乳和牛乳β-酪蛋白總巰基和表面巰基含量。從表4可以看出，兩種蛋白表面巰基含量相似，但羊乳β-酪蛋白總巰基含量顯著低于牛乳β-酪蛋白(p<0.05)，這說明羊乳β-酪蛋白的巰基主要以暴露巰基的形式分布于蛋白質分子的表面，其內(nèi)部巰基含量更低。巰基是蛋白質中重要的功能基團之一，具有較高的生物活性，其可與二硫鍵在巰基/二硫鍵氧化還原酶的催化下進行相互轉化，羊乳β-酪蛋白膠束內(nèi)部更低的巰基含量使其內(nèi)部二硫鍵含量更少。

表4 羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白總巰基和表面巰基含量Table 4 Total and surface sulfhydryl content of goat milk β-casein and bovine milk β-casein

注：同列肩標字母不同表示差異顯著(p<0.05)

Note: Difference letters in the same column indicate significant difference (p<0.05)

2.3.2 羊乳和牛乳β-酪蛋白溶解性的測定

溶解性可以反映出蛋白質內(nèi)部結構發(fā)生變性和聚集的程度，是蛋白質最重要的物理、化學和功能性質之一。羊乳和牛乳β-酪蛋白在不同pH值條件下的溶解性曲線如圖7所示。從圖7可以看出，兩種蛋白的溶解性具有明顯的pH依賴性，且二者等電點(pH為4～5)接近，溶解性曲線均呈現(xiàn)出在接近等電點時溶解性降低，遠離等電點時溶解性升高的趨勢。

當兩種蛋白溶液的pH值在等電點附近時，蛋白分子表面所帶的正電荷與負電荷恰好相等，導致蛋白分子與分子間的相互作用力增強，此時羊乳β-酪蛋白比牛乳β-酪蛋白的溶解性低，說明羊乳β-酪蛋白分子表面包含更多的疏水基團；當兩種蛋白溶液的pH值遠離等電點時(pH 2～4和pH 6～10)，蛋白分子則處于酸性或堿性的環(huán)境中，此時蛋白質分子帶有靜電荷，由于靜電排斥和離子水化作用，蛋白質分子之間不易聚集，因此溶解性較高，同時，溶液中離子強度的增大使蛋白表面的電荷發(fā)生堆積，促進蛋白結構的展開，且結合表4可知，羊乳β-酪蛋白包裹在膠束內(nèi)部的巰基含量低于牛乳β-酪蛋白，因此這很好的解釋了羊乳β-酪蛋白在偏離等電點時溶解性更高的原因。

圖7 羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白的溶解性-pH曲線

3 結 論

圓二色光譜和紅外光譜檢測結果表明：與牛乳β-酪蛋白相比，羊乳β-酪蛋白二級結構中α-螺旋、β-折疊和β-轉角的含量更少，無規(guī)卷曲含量更高，羊乳β-酪蛋白分子結構更傾向于無序性，蛋白分子的柔韌性更好。

羊乳β-酪蛋白與牛乳β-酪蛋白表面巰基含量相似，但前者總巰基含量顯著低于后者，羊乳β-酪蛋白內(nèi)部巰基含量更低。

羊乳β-酪蛋白和牛乳β-酪蛋白在接近等電點(pH為4～5)時，溶解性降低，遠離等電點溶解性升高。在pH 2～4和pH 6～10時，羊乳β-酪蛋白溶解性高于牛乳β-酪蛋白，而在等電點時前者溶解性低于后者，羊乳β-酪蛋白分子與分子間相互作用力更強，分子表面包含了更多的疏水基團。