留置針的細(xì)胞毒性和遺傳毒性研究

河南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （河南 鄭州 450018）

內(nèi)容提要： 目的：評(píng)價(jià)留置針的生物安全性。方法：采用GB/T16886.5和YY0870.2中的方法對(duì)4種留置針進(jìn)行細(xì)胞毒性和遺傳毒性的檢測(cè)。結(jié)果：細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，4種留置針的細(xì)胞增殖率均大于70%，符合無(wú)細(xì)胞毒性的判定；遺傳毒性試驗(yàn)中，4種留置針檢測(cè)結(jié)果均與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異。結(jié)論：4種留置針均具有良好的生物安全性。

靜脈留置針主要由可以保留在患者血管內(nèi)的柔軟套管和進(jìn)行穿刺的不銹鋼穿刺針組成。使用時(shí)將套管和穿刺針一起穿刺入血管內(nèi)，當(dāng)留置針全部進(jìn)入患者的血管后，醫(yī)院人員回撤出穿刺針，僅將柔軟的導(dǎo)管留置在血管內(nèi)從而進(jìn)行輸液治療，能減少患者尤其是幼兒和老年人因反復(fù)靜脈穿刺而造成的痛苦[1]。在手術(shù)和麻醉中，留置針的使用更加不可缺少，因其不僅能夠減少局部炎性等反應(yīng)的發(fā)生，還具有易固定、不易脫落、輸液快速、用藥方便及時(shí)等優(yōu)點(diǎn)[2]。20世紀(jì)80年代，留置針進(jìn)入亞洲的發(fā)達(dá)國(guó)家，90年代，開(kāi)放式留置針率先進(jìn)入中國(guó)手術(shù)室，其后應(yīng)用越來(lái)越廣泛，首先在兒科受到廣泛的應(yīng)用，并逐漸地在其他科室推廣開(kāi)來(lái)。

由于留置針直接與血液進(jìn)行接觸，其新產(chǎn)品的生物安全性顯得十分的重要，因此筆者選取了4種留置針對(duì)其細(xì)胞毒性和遺傳毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其臨床使用提供安全性參考。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試驗(yàn)樣品：試樣樣品為4個(gè)不同廠商的留置針，浸提比例選用0.2g/mL，細(xì)胞毒性的浸提介質(zhì)為含血清的MEM培養(yǎng)基，遺傳毒性的浸提介質(zhì)為含血清的MEM培養(yǎng)基和生理鹽水。

儀器：培養(yǎng)箱（Thermo Fisher公司4131型），顯微成像系統(tǒng)（萊卡DM6000B）顯微鏡（Nikon公司T-DH型），細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Millipore公司Scepter型），全波長(zhǎng)掃描讀數(shù)儀（Thermo Scientific公司Varioskan Flasg型）。

試劑：L-929小鼠成纖維細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞所），CHL倉(cāng)鼠肺細(xì)胞細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞所），胎牛血清（Gibco；1912660C），MEM培養(yǎng)基（Gibco；1897268），胰酶（Gibco；1869828），異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；20160217），MTT（Sigma；MKBN7264V），DMSO（Sigma；RNBD8359）S9（Moltox；1830857），秋水仙素（北京百靈威科技有限公司；LT20Q33），環(huán)磷酰胺（Sigma；43H0269），絲裂霉素（西亞試劑；I5216）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

用0.25%胰酶將L929細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中消化后移出，細(xì)胞懸液在1000r/min離心5min。用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL。將配制好的細(xì)胞懸液每孔接種100μL，接種于96孔培養(yǎng)板。置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24h。

24h后棄去原培養(yǎng)液。每孔加入100μL樣品浸提液、或陰性對(duì)照液、或陽(yáng)性對(duì)照液或空白的處理培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。

之后將培養(yǎng)板置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞的形態(tài)。棄去原孔內(nèi)溶液后，每孔加入50μL質(zhì)量濃度為1g/L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h后棄去96孔板內(nèi)的液體，加入100μL異丙醇。勻速震蕩平板10min，在全波長(zhǎng)掃描讀數(shù)儀的570nm（測(cè)定波長(zhǎng)）和650nm波長(zhǎng)（參照波長(zhǎng)）下測(cè)定吸光度。

96孔板中活細(xì)胞的減少會(huì)導(dǎo)致樣品中代謝活性降低，這與生成的藍(lán)紫色甲臜量有關(guān)，在570nm測(cè)量吸光度，按下式計(jì)算存活率（公式（1））：

注：OD570e——試樣樣品100%浸提液光密度平均值；OD570b—空白光密度平均值。

空白OD570平均值如≥0.2，則試驗(yàn)符合接受標(biāo)準(zhǔn)，如試驗(yàn)樣品細(xì)胞存活率≥空白的70%，則認(rèn)為試驗(yàn)樣品無(wú)細(xì)胞毒性[3]。

1.2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

將一定數(shù)量的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。

24h后吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入試驗(yàn)或?qū)φ諛悠?、S9混合液（不加S9混合液時(shí)，用培養(yǎng)液補(bǔ)足）和細(xì)胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中。有活化系統(tǒng)的接觸4h，無(wú)活化系統(tǒng)的接觸20h；吸去培養(yǎng)皿中的液體，用PBS緩沖液洗細(xì)胞3次，加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并在接觸開(kāi)始后的24h收獲細(xì)胞。于收獲前4h加入秋水仙素，終濃度1μg/mL。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組同法制備。無(wú)S9混合液活化系統(tǒng)采用絲裂霉素，新鮮配制，終濃度為0.5μg/mL；有S9混合液活化系統(tǒng)采用環(huán)磷酰胺，終濃度為80μg/mL。

消化細(xì)胞后加入含血清細(xì)胞培養(yǎng)液，以200g，離心10min，棄去上清溶液。加入0.075mol/L氯化鉀溶液5mL，用一次性吹管將細(xì)胞吹打均勻，置于37℃水浴中低滲處理20min，然后加入1mL甲醇：冰醋酸=3:1的固定液，吹打均勻。1500r/min離心10min，棄去上清液。再加入5mL固定液，混勻后固定20min，以1500r/min離心10min，棄去上清液。同法固定2次，棄掉上清液。加入新鮮固定液，混合均勻。將混懸液滴于預(yù)冷過(guò)的載玻片上，干燥。將滴片用吉姆薩染液染色，晾干后在光學(xué)顯微鏡下每一試驗(yàn)組選擇200個(gè)分散良好的中期分裂相進(jìn)行染色體畸變分析[4]。

2.結(jié)果

表1.細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，4種留置針均表現(xiàn)出良好的生物安全性。顯微鏡下觀察可見(jiàn)，試驗(yàn)樣品組細(xì)胞形態(tài)正常，貼壁生長(zhǎng)良好，胞漿內(nèi)有離散顆粒，極少見(jiàn)細(xì)胞溶解。使用MTT法檢測(cè)其吸光度，經(jīng)計(jì)算得出試驗(yàn)樣品組細(xì)胞增殖率均＞70%，并且它們的細(xì)胞增殖率均在80%以上，表現(xiàn)出良好的生物相容性。根據(jù)GB/T16886.5-2017中MTT試驗(yàn)方法的判斷標(biāo)準(zhǔn)，4種留置針均為無(wú)潛在的細(xì)胞毒性。4種留置針細(xì)胞毒性具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果

在光學(xué)顯微鏡下每一試驗(yàn)組選擇200個(gè)分散良好的中期分裂相進(jìn)行染色體畸變分析。用χ2檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，陰性對(duì)照組染色體畸變率在正常范圍內(nèi)（均＜4.9%），陽(yáng)性對(duì)照組絲裂霉素C（0.25μg/mL）/環(huán)磷酰胺（80 μg/mL）在相同實(shí)驗(yàn)條件下中出現(xiàn)多倍體等數(shù)目的改變，也出現(xiàn)斷裂、裂隙燈染色體結(jié)構(gòu)的改變，染色體畸變率較陰性對(duì)照組顯著增加（P＜0.01），表明所采用實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可靠。在顯微鏡下觀察各試驗(yàn)樣品組，各組染色體形態(tài)正常。經(jīng)統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)樣品組的畸變率均＜5%，與陰性對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異，表明4種留置針的染色體畸變?cè)囼?yàn)均為陰性。遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2.染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

3.討論

留置針在穿刺的過(guò)程中會(huì)和循環(huán)血路接觸，留置在體內(nèi)的部分與人體血路直接接觸的時(shí)間更長(zhǎng)，使用過(guò)程中可能會(huì)導(dǎo)致一些炎癥等不良反應(yīng)，對(duì)護(hù)理人員的操作也提出一定的要求，以避免出現(xiàn)脫管、堵管等現(xiàn)象[5]。但是由于其能夠減少穿刺次數(shù)，便于護(hù)理等優(yōu)點(diǎn)，這些年的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，正因如此，其生物安全性一定要得到保證，筆者選取了四種留置針，對(duì)其進(jìn)行了細(xì)胞毒性和染色體畸變?cè)囼?yàn)的研究，其中細(xì)胞毒性可以判斷其短期的毒性，遺傳毒性可以判斷其較長(zhǎng)期的毒性。試驗(yàn)結(jié)果表明，四種留置針其細(xì)胞增殖率與陰性對(duì)照相比均大于80%，根據(jù)GB/T16886.5-2017的判定標(biāo)準(zhǔn)，均無(wú)細(xì)胞毒性；四種留置針的染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果均與陰性對(duì)照相比無(wú)顯著性差異，顯示出良好的生物安全性。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，留置針產(chǎn)品的不斷更新，許多新型的材質(zhì)和型號(hào)也都出現(xiàn)，因此對(duì)于其毒性的研究也要隨著技術(shù)的進(jìn)步不斷進(jìn)行。