西地那非通過上調(diào)電壓依賴性鉀通道抗低氧刺激的人肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖

毛 婷,張京春,王躍秀,喬 羽,劉 蓓,張 珊

(中國中醫(yī)科學(xué)院1.西苑醫(yī)院心血管科、2.心血管病研究所，北京 100091；3.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，北京 100069)

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)與肺血管重構(gòu)密切相關(guān)，特別是肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增殖異常導(dǎo)致的肺動脈管壁中膜增厚，管腔狹窄。電壓依賴性鉀通道(voltage-dependent potassium channels，Kv)活性與肺動脈高壓、肺血管平滑肌細(xì)胞增殖所致肺血管重構(gòu)密切相關(guān)[1]。低氧引起PASMCs的氧敏感性Kv通道活性和表達(dá)降低，PASMCs過度增殖進(jìn)而肺血管重構(gòu)[2,3]。近來，西地那非為一種選擇性的磷酸二酯酶V(phosphodiesterase 5，PDE5)抑制劑被用來治療肺動脈高壓，其機(jī)制主要涉及肺動脈高壓時肺血管平滑肌細(xì)胞的PDE5表達(dá)和活性大大增加，西地那非可通過選擇性抑制PDE5活性，增加PASMCs內(nèi)的環(huán)鳥苷一磷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平，進(jìn)而激活環(huán)鳥甘酸依賴性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，PKG)，擴(kuò)張肺動脈，抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增殖以改善肺血管重構(gòu)及肺血流動力學(xué)。而西地那非能否通過Kv通道影響低氧刺激的PASMCs增殖尚未見研究報道。慢性低氧抑制Kv通道尤其是Kv1.5通道功能是PASMCs增殖異常的關(guān)鍵機(jī)制。探索西地那非抗低氧刺激的PASMCs增殖以減輕肺血管重構(gòu)與Kv1.5通道及PKG的關(guān)系是本研究的主要目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株及培養(yǎng)基原代人PASMCs、平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(smooth muscle cell basic medium，SMBM)和平滑肌細(xì)胞生長補(bǔ)充物(smooth muscle growth supplement，SMGS)均購自美國Cascade Biologics公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購于美國Gibcobrl公司。

1.2 試劑及儀器西地那非(純品)購于美國輝瑞公司；PKG抑制劑KT-5823購于德國Merck公司；兔抗人Kv1.5抗體(APC-150)購于以色列Alomone公司；羊抗兔二抗(C50331)購于美國LI-COR公司，兔抗人Ki67抗體(ab15580)購于英國Abcam公司；脂質(zhì)體2000(Lipo2000)(1168000)購于美國Invitrogen公司；Kv1.5基因的小分子干擾RNA片斷(siRNA)序列如Tab 1所示，劑型為凍干粉，合成于美國ThermoFisher公司。膜片鉗放大器(德國HEKA EPC10)；倒置顯微鏡(TE2000-U，日本Nikon)；三維顯微操作儀(美國Sutter MP285)；數(shù)據(jù)采集軟件(美國Patchmaster 2.0)；數(shù)據(jù)分析軟件(美國Origin 8.0)；電極拉制儀(日本Narishige Model PC-10)；玻璃電極毛坯(美國Sutter BF150-110-10型)。

Tab 1 siRNA sequence

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)分組與干預(yù)方法取第4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞在平滑肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基(smooth muscle growth medium，SMGM)中培養(yǎng)24 h后，更換成SMBM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再更換成含2% FBS SMBM繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分組如下，常氧對照組(Nor)：PASMCs于常氧孵箱(21% O2)中常規(guī)培養(yǎng)72 h；低氧對照組(Hyp)：PASMCs于低氧孵箱(3% O2)中培養(yǎng)72 h；低氧+西地那非組(Hyp+Sil)：西地那非(100 nmol·L-1)干預(yù)低氧孵箱中的PASMCs 72 h；低氧+西地那非+KT-5823組(Hyp+Sil+KT-5823)：西地那非(100 nmol·L-1)與KT-5823(300 nmol·L-1)共同干預(yù)低氧孵箱中的PASMCs 72 h；低氧+西地那非+siRNA-Kv1.5組(Hyp+Sil+siRNA-Kv1.5)：用加入siRNA-Kv1.5 lipo2000混合液的培養(yǎng)基于常氧孵箱中培養(yǎng)PASMCs 6 h，再更換成含2% FBS SMBM，加入西地那非后于低氧孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1DAPI染色法檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種于直徑12 mm的圓玻片上分組培養(yǎng)72 h，PBS沖洗后用冷4%多聚甲醛固定細(xì)胞，再透化處理細(xì)胞后PBS沖洗。每片取200 μL DAPI液(1 μg·mL-1)于室溫避光孵育細(xì)胞，PBS沖洗。將圓玻片置于熒光顯微鏡下觀察，每張片子于高倍鏡(×200)視野下隨機(jī)選擇4個視野，計算其細(xì)胞數(shù)目并取其均值。

1.4.2細(xì)胞免疫熒光染色法檢測細(xì)胞增殖 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞接種于預(yù)先置入小玻片的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)72 h，D-PBS沖洗玻片，接著4%多聚甲醛室溫固定玻片。然后用2%的BSA/D-PBS洗，接著用10%羊血清封閉。透化緩沖液室溫孵育?？贵wanti-Ki67(1 ∶100)4 ℃作用于玻片過夜，再沖洗。二抗(Alexa Fluor 594標(biāo)記的兔抗人IgG，1 ∶100)于室溫孵育玻片， D-PBS洗后封片。將每張玻片于熒光正置顯微鏡高倍鏡(×200)視野下觀察，隨機(jī)選擇5個視野計算DAPI染核細(xì)胞核數(shù)目(藍(lán)色熒光)、Ki67陽性染色細(xì)胞數(shù)目(紅色熒光)并取其均值。采用LEICA QWin Plus軟件分析，以Ki67陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(紅色熒光細(xì)胞數(shù)目/藍(lán)色熒光細(xì)胞核數(shù)目)代表細(xì)胞增殖程度。

1.4.3MTT法檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞懸液接種于96孔板，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組。第一組細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天(即d 0)加入MTT，其余組細(xì)胞于72 h后加入MTT，添加助溶劑，于搖床上混勻使甲瓚顆粒充分溶解，采用酶標(biāo)儀檢測波長490 nm波長處各孔光吸收值，即為甲瓚的生成量。

1.4.4Western blot法檢測siRNA沉默后的Kv1.5表達(dá) 測定低氧下西地那非孵育沉默Kv1.5的細(xì)胞上的Kv1.5表達(dá)水平。提取全細(xì)胞蛋白，制備蛋白樣品，取20 μL(40 μg)全細(xì)胞蛋白電泳樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，封閉液室溫封閉1 h，洗膜后用一抗Kv1.5兔源性多克隆抗體(1 ∶50)于4 ℃孵育過夜，次日取出置于搖床上室溫再作用1 h，漂洗膜，接著用二抗羊抗兔IgG溶液(1 ∶10 000)室溫孵育1 h，漂洗后進(jìn)行掃膜。將膜置于Odyssey紅外熒光成像儀中進(jìn)行拍照，采用ImageJ 1.38圖像軟件分析其熒光強(qiáng)度，得出目的蛋白Kv1.5與β-actin的比值，即為Kv1.5蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 轉(zhuǎn)染組分為4組：① 陰性對照組(NC組)；② 空白對照組(BC組)；③ siRNA-Kv1.5組(s1組)、④ siRNA-Kv1.5組(s8組)。用帶有熒光標(biāo)記的陰性對照siRNA 優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，評價轉(zhuǎn)染效率；Western blot 法檢測干擾前后Kv1.5蛋白表達(dá)情況。用siRNA-Kv1.5 lipo 2000混合液孵育細(xì)胞6 h，更換新鮮培養(yǎng)基同時加入西地那非干預(yù)細(xì)胞，于低氧孵箱中培養(yǎng)72 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.6電生理實(shí)驗(yàn)的溶液配制記錄Kv通道電流的溶液配方：電極內(nèi)液配方(mmol·L-1)：135 KCl，4 MgCl2，10 HEPES，10 EGTA，5 Na2ATP(KOH調(diào)節(jié)pH至7.2)；浴液配方(mmol·L-1)：141 NaCl，4.7 KCl，3.0 MgCl2·6H2O，10 HEPES，1 EGTA，10 Glucose(NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4)；電極內(nèi)液中高濃度的Na2ATP用于抑制ATP敏感性鉀通道電流；電極內(nèi)液及浴液均不含Ca2+，且添加了Ca2+螯合劑，以最大限度地抑制大電導(dǎo)鈣激活性鉀通道活性，以避免其干擾。從而所記錄的基本為Kv電流[3]。以上實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

1.4.7全細(xì)胞膜片鉗記錄 應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，檢測各組間細(xì)胞的全細(xì)胞K+電流，采用Step-Kv全細(xì)胞記錄模式(見Fig 1)。在倒置顯微鏡(TE2000-U)下選擇貼壁良好、形狀規(guī)則、邊緣清楚、表面光滑、無收縮的細(xì)胞。在封接電阻>1 GΩ形成高阻封接的全細(xì)胞模式下，將細(xì)胞膜電位鉗制在-70 mV，發(fā)放步階脈沖電壓刺激，以20 mV為步階，從-60 mV逐步階越至+80 mV，持續(xù)時間300 ms，記錄全細(xì)胞K+電流。

1.4.8全細(xì)胞K+電流的采集及分析 全細(xì)胞K+電流信號經(jīng)膜片鉗放大器輸入數(shù)模轉(zhuǎn)換器PatchMaster EPC10(HEKA Electronikes,Lambrecht，Germany)采集后輸入計算機(jī)。實(shí)驗(yàn)過程中通過PatchMaster 2.0軟件補(bǔ)償電極電容，設(shè)置放大器增益100 mV·pA-1，采樣頻率10 KHz，低通濾波2.9～1.0 KHz。PatchMaster 2.0軟件進(jìn)行采集記錄，Origin 8.0(Origin Lab，Northampton，MA)和Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。記錄不同電壓刺激下的K+通道電流，同時記錄加入5 mmol·L-1TEA(K+通道阻斷劑)前后K+通道電流幅值及密度。

Fig 1 Protocol of step voltage stimulation in whole-cell patch clamp recording

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 12.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及繪圖，兩組數(shù)據(jù)間差異用Student’s t-test。多組間資料采用One-way ANOVA方差分析，然后Student-Newman-Keuls(SNK)方法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 西地那非抑制低氧刺激的PASMCs增殖MTT結(jié)果如Fig 2顯示：低氧較常氧對照組可明顯促進(jìn)PASMCs增殖(P<0.01)。在低氧下用西地那非共孵育細(xì)胞，采用DAPI染核計數(shù)，結(jié)果如Fig 3顯示：西地那非組較低氧對照組可顯著減少低氧刺激的細(xì)胞DAPI染核數(shù)量(P<0.05)。細(xì)胞免疫熒光染色法檢測增殖核性抗原Ki67的結(jié)果如Fig 4顯示：低氧較常氧對照組可顯著增加Ki67陽性染色細(xì)胞數(shù)目；西地那非組較低氧對照組可明顯減少低氧下的Ki67陽性染色細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)。以上表明西地那非能夠抗低氧刺激的人PASMCs增殖。

Fig 2 Proliferation of human PASMCs

PASMCs were incubated under normoxia (Nor) and hypoxia (Hyp),respectively.**P<0.01vsNor.

Fig 3 Hypoxia-induced human PASMC proliferation inhibited by sildenafil

A: Result of DAPI staining (200×); B: Statistical result. PASMCs were incubated under normoxia (Nor),hypoxia(Hyp) or hypoxia with sildenafil treatment(Hyp+Sil),respectively.**P<0.01vsNor;#P<0.05vsHyp.

2.2 西地那非翻轉(zhuǎn)了低氧刺激的PASMCs的K+通道電流尤其Kv1.5通道電流的降低接下來為了探討西地那非抗低氧刺激的PASMCs增殖是否與K+通道電流變化相關(guān)，本研究采用膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞K+通道基礎(chǔ)電流。結(jié)果如Fig 5所示：低氧下的細(xì)胞K+通道基礎(chǔ)電流較常氧對照組明顯降低(P<0.01)；低氧對照組西地那非明顯翻轉(zhuǎn)了低氧刺激的K+通道基礎(chǔ)電流的降低效應(yīng)(P<0.05)。接著在膜片鉗全細(xì)胞記錄模式下采用5 mmol·L-1TEA(被認(rèn)為能夠阻斷Kv通道)灌流細(xì)胞浴液，以觀察西地那非組的K+電流，以進(jìn)一步驗(yàn)證西地那非所增加的細(xì)胞K+電流成分是否含Kv通道電流。結(jié)果如Fig 6所示：與低氧下對照組相比，TEA抑制了西地那非所增加的K+通道電流(P<0.05)。提示西地那非翻轉(zhuǎn)的主要是Kv通道電流。為了進(jìn)一步觀察Kv1.5是否為西地那非翻轉(zhuǎn)的Kv通道電流成分，記錄在電極內(nèi)液中加入特異性Kv1.5抗體(1 ∶125)前后的電流值，這兩組電流差值代表西地那非翻轉(zhuǎn)低氧降低的Kv1.5電流(即Kv1.5抗體效應(yīng)值)。結(jié)果如Fig 7所示：Kv1.5抗體透析使低氧下西地那非組的K+電流降低了28%(P<0.01)，而低氧對照組的K+電流無明顯變化。

A: Result of Ki67 positive cell nuclei (200×); B:Statistical result.**P<0.01vsNor;##P<0.01vsHyp.

2.3 沉默Kv1.5基因?qū)v1.5蛋白及西地那非抗低氧刺激的細(xì)胞增殖的影響利用優(yōu)化好的轉(zhuǎn)染條件，將兩對干擾Kv1.5基因的siRNA(s1,s8)分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。Western blot結(jié)果如Fig 8所示：s1、s8對Kv1.5蛋白的干擾效率分別是51.3%、60.2%。與對照組相比，沉默Kv1.5基因的siRNA(s1)組的低氧下西地那非干預(yù)的細(xì)胞Kv1.5蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，s8組的Kv1.5蛋白表達(dá)水平也明顯降低(P<0.01)。MTT結(jié)果如Fig 9所示：與對照組相比，siRNA(s1)組的低氧下西地那非干預(yù)的細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，s8組的細(xì)胞活力也明顯增強(qiáng)(P<0.01)。以上表明沉默Kv1.5基因能夠逆轉(zhuǎn)西地那非對低氧刺激的細(xì)胞增殖的抑制作用。從而間接證明西地那非可能通過上調(diào)Kv1.5表達(dá)起到抗低氧刺激的細(xì)胞增殖作用。

Fig 5 Hypoxia-decreased K+ currents in human PASMCs reversed by sildenafil

A: Representative whole-cell K+currents elicited by depolarizing the cells to a series of test potentials ranging from -60 mV to +80 mV in 20mV increments from a holding potential of -70 mV in PASMC incubated under normoxia (Nor) and hypoxia(Hyp) or hypoxia with sildenafil treatment(Hyp+Sil),respectively. B: Composite current-voltage (I-V) relationship curves from PASMCs cultured in respective conditions.**P<0.01vsNor;#P<0.05vsHyp.

Fig 6 Sildenafil-increased K+ current in human PASMCs exposed to hypoxia inhibited by TEA

A:Representative whole-cell K+current trace from PASMCs pretreated with sildenafil before (Hyp+Sil) and after induced by TEA (Hyp+Sil+TEA). B: Composite current-voltage (I-V) relationship curves.*P<0.05vsHyp+Sil.

2.4 PKG抑制劑KT-5823逆轉(zhuǎn)西地那非抗低氧刺激的細(xì)胞增殖細(xì)胞免疫熒光染色Ki67及MTT法檢測低氧下西地那非與PKG抑制劑KT-5823共孵育對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如Fig 10所示：KT-5823能夠逆轉(zhuǎn)西地那非抗低氧刺激的細(xì)胞增殖作用(P<0.05)。

Fig 7 K+ currents recorded from human PASMCs pretreated

**P<0.01vsBefore anti-Kv1.5 dialysis

2.5 KT-5823抑制西地那非對低氧下細(xì)胞 K+通道電流的上調(diào)作用接著為了觀察KT-5823逆轉(zhuǎn)西地那非抗細(xì)胞增殖作用是否與K+通道活性變化有關(guān)。在膜片鉗全細(xì)胞記錄模式下，我們記錄了低氧下KT-5823與西地那非共孵育細(xì)胞前后的K+通道電流，結(jié)果如Fig 11所示：KT-5823部分阻斷了低氧下西地那非對K+通道電流的上調(diào)作用，K+通道電流降低了34.6%(P<0.05)。以上提示，KT-5823通過阻斷低氧下西地那非對K+通道電流的上調(diào)，從而逆轉(zhuǎn)西地那非抗低氧刺激的細(xì)胞增殖作用。

3 討論

肺動脈壓升高和肺血管重構(gòu)是HPH的主要病理生理特征。大量研究證實(shí)，低氧引起的PASMCs增殖是導(dǎo)致肺血管重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)之一，Kv通道異常與肺動脈高壓及肺血管重構(gòu)關(guān)系密切[4,5]。低氧引起PASMCs的Kv通道活性和表達(dá)降低，細(xì)胞膜發(fā)生去極化，引起胞內(nèi)的Ca2+濃度增加，導(dǎo)致肺血管收縮、肺動脈壓漸進(jìn)性升高和PASMCs過度增殖甚至肺血管重構(gòu)[6]。因此，通過何種途徑干預(yù)和調(diào)控Kv通道成為防治肺動脈高壓的熱點(diǎn)。西地那非在臨床上用來治療肺動脈高壓，它不僅能抑制肺血管收縮、擴(kuò)張肺血管、降低肺動脈壓力，同時也可以抑制PASMCs增殖導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)[7]。

Fig 8 Expression of Kv1.5 protein in human PASMCs pretreated with sildenafil under hypoxia inhibited by silencing

A: Kv1.5 protein expression after silencing Kv1.5 gene with siRNA. B: Statistical graph. NC: negative control. BC: Blank control. s1,s8: siRNA.*P<0.05,**P<0.01vsHyp+Sil

Fig 9 The inhibitory effect of sildenafil on hypoxia-stimulatedcell proliferation reversed by silencing Kv1.5 gene

Statistical result of cell viability.*P<0.05,**P<0.01vsHyp+Sil.

Fig 10 The inhibitory effect of sildenafil on hypoxia-stimulated cell proliferation reversed by

A: Statistical result of Ki67 positive cell nuclei. B: Statistical result of cell viability from PASMCs without (Hyp+Sil) or with KT-5823 (Hyp+Sil+KT-5823) treatment in the presence of sildenafil under hypoxia.**P<0.01vsHyp;#P<0.05vsHyp+Sil.

本研究發(fā)現(xiàn)，西地那非能抗低氧刺激的PASMCs增殖；低氧引起PASMCs的Kv通道尤其Kv1.5通道電流幅度降低；西地那非能夠逆轉(zhuǎn)低氧對Kv通道電流尤其Kv1.5通道電流的下調(diào)作用；根據(jù)靶基因Kv.1.5設(shè)計的siRNA(s1、s8)同時用于實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檫@兩對siRNA可互為脫靶對照，可以最大程度地避免脫靶效應(yīng)的影響。經(jīng)我們實(shí)驗(yàn)篩選得到了沉默效率較高的siRNA序列(s1、s8)，體現(xiàn)在細(xì)胞Kv.1.5蛋白表達(dá)水平不同，由于Kv.1.5基因及蛋白表達(dá)在低氧刺激的PASMCs細(xì)胞增殖中起著關(guān)鍵作用，因此s1、s8沉默靶基因Kv1.5導(dǎo)致西地那非干預(yù)下的低氧刺激的細(xì)胞增殖水平不同,有力地提示了西地那非抗低氧刺激的細(xì)胞增殖效應(yīng)可能與Kv1.5基因及蛋白表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。KT-5823能夠逆轉(zhuǎn)西地那非抗低氧刺激的細(xì)胞增殖效應(yīng)，可能與KT-5823阻斷低氧下西地那非對K+通道電流的上調(diào)作用有關(guān)。因此，本研究表明西地那非通過上調(diào)Kv通道亞型Kv1.5抑制低氧刺激的人PASMCs增殖，且可能與PKG通路激活有關(guān)。

Fig 11 Sildenafil-increased K+ currents of human PASMCs under hypoxia reversed by

A:Representative whole-cell K+current trace.B:Composite current-voltage(I-V) relationship curves.**P<0.01vsHyp;#P<0.05vsHyp+Sil.

近年來的研究發(fā)現(xiàn)低氧可通過各種信號通路引起肺血管功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中低氧是始動的關(guān)鍵因素[8]。Kv作為K+通道主要亞型，被認(rèn)為是PASMCs的主要氧感受器。Kv通道電流是細(xì)胞膜電位的主要組分，研究發(fā)現(xiàn)氧敏感性Kv通道主要包括Kv1.1、Kv1.2、Kv1.3、Kv1.5、Kv2.1等亞型，它們的表達(dá)和功能異常是引起細(xì)胞膜電位去極化，促進(jìn)PASMCs增殖導(dǎo)致肺血管重構(gòu)的重要因素之一[9]。有研究報道，Kv1.5在調(diào)控細(xì)胞膜電位及低氧性PASMCs增殖方面尤為重要[10]。存在Kv1.5基因突變的PASMCs在低氧刺激下，細(xì)胞增殖被顯著抑制[11]。本研究中采用siRNA沉默Kv1.5基因后，西地那非的抗細(xì)胞增殖效應(yīng)被抑制，與文獻(xiàn)報道結(jié)論一致。低氧抑制氧敏感性Kv1.5通道表達(dá)與功能是引起PASMCs過度增殖的重要機(jī)制。低氧使Kv通道的表達(dá)與功能降低，進(jìn)而細(xì)胞膜發(fā)生去極化，電壓依賴性鈣通道開放，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)的Ca2+濃度增加，從而促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，加快細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期；另外，Ca2+還能夠激活胞內(nèi)的多種依賴Ca2+的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，直接或間接促進(jìn)細(xì)胞增殖[12]。由此證明Kv通道是調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位和胞內(nèi)的Ca2+濃度的效應(yīng)器。因此，阻斷低氧抑制的Kv通道，有可能成為防治肺動脈高壓的重要途徑之一。

肺動脈高壓時肺血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的PDE5表達(dá)和活性明顯增加，西地那非作為一種選擇性PDE5抑制劑，其機(jī)制主要是通過抑制PDE5活性，顯著地減少PDE5對cGMP的降解，從而升高cGMP水平，進(jìn)而發(fā)揮治療作用，其PDE5/cGMP/PKG信號通路在調(diào)節(jié)血管張力、細(xì)胞增殖等過程中起重要作用。cGMP是PASMCs內(nèi)重要的第二信使，不僅能夠降低胞內(nèi)的Ca2+濃度，從而促進(jìn)肺血管舒張，降低PASMCs增殖，而且能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。另外，一氧化氮通過激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，催化三磷酸鳥苷轉(zhuǎn)化生成cGMP，激活其下游的蛋白激酶PKG，開放K+通道，細(xì)胞膜電位發(fā)生超極化，引起電壓依賴性鈣通道失活，Ca2+內(nèi)流減少，胞內(nèi)的Ca2+水平降低[14]。此外，PKG還可通過抑制肌醇三磷酸釋放或調(diào)控三磷酸肌醇受體減少胞內(nèi)鈣庫Ca2+的釋放，使平滑肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平降低，從而抑制血管平滑肌收縮，同時降低PASMCs增殖[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，西地那非可能通過上調(diào)Kv通道，尤其是Kv1.5通道抑制低氧刺激的人PASMCs增殖，且可能與PKG信號通路激活有關(guān)。但無論通過何種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，低氧終會通過改變細(xì)胞膜上的Kv通道功能，影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。進(jìn)一步探討低氧刺激的Kv通道功能降低、胞內(nèi)的Ca2+濃度異常升高的分子機(jī)制，找到阻斷這種Ca2+異常升高途徑的有效切入點(diǎn)，對于改善肺血管重構(gòu)具有重要意義。