丹參莖葉酚酸組分對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的干預(yù)作用

彭珂毓，顧俊菲，宿樹蘭，朱 悅，郭建明，錢大瑋，段金廒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點(diǎn)研究室、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室，江蘇 南京 210023)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是由宿主胃腸道微生物群落的異常免疫應(yīng)答引起的慢性特發(fā)性疾病，是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的重要臨床亞型，其病因和發(fā)病機(jī)制不明。近年來(lái)，UC的發(fā)病率急劇上升且已不再局限于西方國(guó)家。在我國(guó)，隨著人們生活環(huán)境與方式的改變，UC的患病率逐年增加[1]。氨基水楊酸類、免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素等為臨床治療UC的常用藥物，長(zhǎng)期應(yīng)用均具有不同程度的副作用[2]。丹參莖葉總酚酸具有保護(hù)糖尿病腎病、糖尿病腸病和改善心血管疾病等多種藥理活性[3-4]，其中丹酚酸類成分具有良好的抗炎活性，能夠修復(fù)腸屏障損傷，調(diào)節(jié)腸道微生物紊亂，增加腸道短鏈脂肪酸含量，達(dá)到對(duì)結(jié)腸炎的保護(hù)治療作用[5-6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹參莖葉中含豐富的酚酸類成分，尤以丹酚酸B和迷迭香酸為主，二者總含量與根中SAB和RA總含量相近，但兩者含量比例與根中不同。隨著丹參大宗產(chǎn)業(yè)不斷開發(fā)利用，帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量未被利用的丹參莖、葉，也帶來(lái)了沉重的環(huán)境負(fù)擔(dān)和資源浪費(fèi)，亟待尋找合理的丹參莖葉資源化利用途徑。

本研究采用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)誘導(dǎo)的UC小鼠模型，從綜合改善癥狀和降低炎癥反應(yīng)方面研究丹參莖葉總酚酸及其所含丹酚酸B和迷迭香酸對(duì)UC模型小鼠的干預(yù)作用，以明確丹參莖葉抗UC的生物效應(yīng)，為丹參莖葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料及儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6小鼠130只，♂，體質(zhì)量(24±2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0003。

1.2 主要試劑柳氮磺吡啶腸溶片(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)09170617)；丹參根總酚酸(西安小草植物科技有限責(zé)任公司，XC20170205)；丹酚酸B和迷迭香酸(南京春秋生物工程有限公司，DFSB20170915、MDXS20180521)，原兒茶醛和蘆丁(中國(guó)食品藥品檢定研究所，110810-201007、100080-201409)，丹參素、丹酚酸A、丹酚酸C、異槲皮苷、山奈酚-3-0-蕓香糖苷和紫云英苷(北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，MUST-13030108、MUST-13030701、MUST-15011305、MUST-15070211、MUST-16041507、MUST-13092006)，純度均大于98%；DSS(MPBIO公司，批號(hào)Q4299)；小鼠IL-6(貨號(hào)H007)、小鼠IL-4(貨號(hào)H005)、小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α，貨號(hào)H052)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物有限公司。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Lot#N10227)和qPCR試劑盒(Lot#M31107)均購(gòu)自TransGene公司。

1.3 儀器ACQUITY UPLC系統(tǒng)(Waters，美國(guó))；ML204及MS-20S型分析天平(METTLER TLEDO，中國(guó))；多功能酶標(biāo)儀(PerkinElmer，美國(guó))；ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR(Applied Biosystems，美國(guó))；RM2016病理切片機(jī)(Leica，德國(guó))；正置光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)。

2 方法

2.1 丹參莖葉總酚酸的制備丹參莖葉樣品于2018年7月采集于陜西銅川，60 ℃烘干除雜后，粉碎成粗粉(40目)。稱取丹參莖葉樣品400 g，參考文獻(xiàn)[7]提取方法制備得到丹參莖葉總酚酸，-30 ℃冰箱保存。

2.2 丹參莖葉總酚酸的成分分析

2.2.1色譜條件 采用UPLC對(duì)制備所得的丹參莖葉總酚酸和購(gòu)買所得丹參根總酚酸進(jìn)行含量測(cè)定。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)，流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，以0.4 mL·min-1的恒定流速進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)樣體積2 μL，柱溫35 ℃。洗脫條件為0～1 min，95%→95% A；1～3 min；95%→90% A；3～7 min，90%→85% A；7～11 min，85%→79% A；11～15 min，79%→67% A；15～17 min，67%→30% A；17～18 min，30%→20% A；18～20 min, 20%→20%；20～21 min，20%→95%)。酚酸類成分檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；黃酮類成分檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷及紫云英苷對(duì)照品適量，用90%甲醇配置成丹參素0.169 g·L-1、原兒茶醛0.245 g·L-1、迷迭香酸0.593 g·L-1、紫草酸0.127 g·L-1、丹酚酸B 0.271 g·L-1、丹酚酸A 0.138 g·L-1、丹酚酸C 0.103 g·L-1、蘆丁0.331 g·L-1、異槲皮苷0.147 g·L-1、山奈酚-3-O-蕓香糖苷0.218 g·L-1及紫云英苷0.217 g·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱取丹參莖葉總酚酸和丹參根總酚酸適量，加入90%甲醇，混勻，離心取上清液過0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.2.4線性關(guān)系、最低檢測(cè)限和最低定量限試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，分別稀釋2、10、20、100、200倍進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制各對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸得各化學(xué)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。最低檢測(cè)限(limit of detection，LOD)和最低定量限(limits of quantification，LOQ)分別在各化合物的信噪比為3和10時(shí)測(cè)定。

2.2.5精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察 精密度試驗(yàn)：精密吸取混合對(duì)照品液連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各成分的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取丹酚莖葉總酚酸適量，按“2.2.3”項(xiàng)條件平行制備6份供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分峰面積的RSD。穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算各成分峰面積的RSD。

2.2.6加樣回收率考察 精密稱取丹酚莖葉總酚酸樣品粉末，分別加入一定量的丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷及紫云英苷對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)條件下制備供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率及RSD。

2.3 藥物配制柳氮磺吡啶腸溶片研碎成粉末，以0.5%的羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose，CMC-Na)混勻成濃度為50 kg·L-1。將丹參莖葉總酚酸、丹參根總酚酸、丹酚酸B及迷迭香酸均充分混勻于0.5%的CMC-Na溶液中，調(diào)整丹參莖葉總酚酸和丹參根總酚酸濃度為20 kg·L-1，丹酚酸B和迷迭香酸濃度為6 kg·L-1。

2.4 動(dòng)物造模及分組小鼠隨機(jī)分為13組：(1) 正常對(duì)照組(Control)；(2) 模型組(Model)；(3) 柳氮磺吡啶腸溶片組(SASP 500 mg·kg-1)；(4、5) 丹參莖葉總酚酸高、低劑量組(DYSAH 200 mg·kg-1、DYSAL100 mg·kg-1)；(6、7) 丹參根總酚酸高、低劑量組(DGSAH 200 mg·kg-1、DGSAL 100 mg·kg-1)；(8、9) 丹酚酸B高、低劑量組(SABH 60 mg·kg-1、SABL 30 mg·kg-1)；(10、11) 迷迭香酸高、低劑量組(RAH 60 mg·kg-1、RAL 30 mg·kg-1)；(12、13)丹酚酸B+迷迭香酸高、低劑量組(S+RH 120 mg·kg-1、S+RL 60 mg·kg-1)。除空白組給予不做任何特殊處理正常飲食飲水外，其余各組均飲用當(dāng)日現(xiàn)配的2% DSS溶液連續(xù)7 d，造模成功后，按體質(zhì)量10 mL·kg-1灌胃給藥7 d，共14 d。

2.5 標(biāo)本采集給藥結(jié)束后，處死小鼠，迅速剖取結(jié)腸測(cè)定長(zhǎng)度后，截取近直腸端1～2 cm放入4%多聚甲醛中固定過夜用于病理學(xué)分析，剩余組織馬上投入液氮速凍0.5 h后，放入-80 ℃冰箱保存。

2.6 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分小鼠造模過程中，通過參考Cooper評(píng)分系統(tǒng)方法評(píng)定疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)以量化結(jié)腸炎。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：體重減輕的變化(0：0，1：1%～5%，2：5%～10%，3：10%～20%，4：>20%)；大便性狀(0：正常，1和2：稀便，3和4：腹瀉)；便血情況(0：陰性，1：+，2：++，3：+++，4：++++)；3項(xiàng)所得平均分即為DAI。

2.7 HE染色上述固定好的結(jié)腸標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察病理?yè)p傷情況。

2.8 ELISA法測(cè)TNF-α、IL-6、IL-4水平取結(jié)腸組織，稱定重量，按比加入冰PBS溶液制成10%組織均漿液，離心后取上清液，按相應(yīng)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定IL-6、COX2、IL-17A mRNA表達(dá)取結(jié)腸組織，加入TRIzol及鋯珠冰上研磨提取總RNA，測(cè)定RNA純度。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后，用qPCR試劑盒以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見Tab 1。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用相對(duì)定量法(2-ΔΔCt)得到目的基因相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 Primer sequences of genes

3 結(jié)果

3.1 丹參莖葉總酚酸和丹參根總酚酸的成分分析結(jié)果比較

3.1.1方法學(xué)考察結(jié)果 各成分的回歸方程、線性范圍、LOD及LOQ結(jié)果如Tab 2所示。精密度試驗(yàn)RSD在1.13%～1.57%，表明儀器精密度良好；重復(fù)性試驗(yàn)RSD在2.41%～3.54%，表明方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD在2.85%～3.95%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；加樣回收率試驗(yàn)回收率在98.1%～104.4%，RSD均小于2.76%。

3.1.2丹參莖葉總酚酸和丹參根總酚酸的成分結(jié)果比較 對(duì)丹參莖葉總酚酸和丹參根總酚酸進(jìn)行成分分析，共確定了其中的11種酚酸黃酮類成分，詳見Tab 3。丹參莖葉總酚酸中主要含有水溶性酚酸類成分和少量黃酮類成分，含量分別為653.8 mg·g-1、18.67 mg·g-1；其中水溶性酚酸類以SAB和RA為主，含量比例接近1 ∶1。丹參根總酚酸主要含有水溶性酚酸類成分含量為780.8 mg·g-1，其中以SAB為主。

Tab 2 Linear regression, LOD and LOQ data

Tab 3 Contents of phenolic acids andflavonoids in DYSA and DGSA(mg·g-1)

3.2 丹參莖葉酚酸組分對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠體重及DAI評(píng)分的影響重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示，正常對(duì)照組與模型組小鼠體重在7 d內(nèi)，兩組間(F=75.40,P=0.00)及不同時(shí)間點(diǎn)間(F=45.23,P=0.00)差異均存在顯著性，并且存在明顯交互效應(yīng)(F=90.56,P=0.00)，表明模型組小鼠體重雖受時(shí)間影響仍明顯低于正常對(duì)照組，見Tab 4。與模型組相比，各給藥組隨給藥治療時(shí)間延長(zhǎng)小鼠體重緩慢增長(zhǎng)，在d 6～d 7恢復(fù)明顯，各組間比較差異有顯著性(F=2.22,P=0.02;F=2.15,P=0.02)。各時(shí)間點(diǎn)間差異有顯著性(F=165.01,P=0.00)，并與組間存在明顯的交互效應(yīng)(F=1.71,P=0.03)。將各給藥組與模型組比較得到SASP、DYSAL、SABH、SABL組間差異無(wú)顯著性，DYSAH、DGSAH、DGSAL、RAH、RAL、S+RH、S+RL組間差異有顯著性。對(duì)各組間進(jìn)行簡(jiǎn)單效應(yīng)分析得到各組間不同時(shí)間點(diǎn)的差異；與模型組相比RAL體重在給藥d 2后即開始明顯回調(diào)(P<0.05)，S+RL在給藥d 3后即開始明顯回調(diào)(P<0.05)，結(jié)合體重均數(shù)趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)RA與S+R比DYSA更有效，見Tab 5。模型組DAI評(píng)分在d 7內(nèi)均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。給藥干預(yù)后，各給藥組小鼠在d 5～d 7水樣及稀便逐漸轉(zhuǎn)變成成形的松散軟便，便血癥狀基本消失，DAI明顯低于模型組(P<0.05)；其中DYSAH與RAH組DAI降低最為明顯(P<0.01)，見Tab 6。

Tab 4 Effect of DSS on weight of DSS-induced ulcerative n≥6)

##P<0.01vscontrol

Tab 5 Effect of DYSA, SAB and RA alone and in combination, on weight of UC

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Tab 6 Effect of DYSA, SAB and RA alone and in combination on DAI score of UC

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig1RepresentativeHE-stainedcolonsections(×200,n=3)

3.3 丹參莖葉酚酸組分對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響由Fig 1結(jié)果可知，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)紊亂水腫，腸腺及隱窩大部分被破壞或消失，腸壁多處潰瘍或糜爛，伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腸腔內(nèi)可見許多壞死細(xì)胞。丹參莖葉酚酸組分給藥干預(yù)后腸道病理狀態(tài)得到不同程度的改善。DYSAH、DYSAL、RAL、S+RH和S+RL組較模型組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整清楚，水腫及炎癥程度得到減輕，表現(xiàn)出明顯的保護(hù)干預(yù)作用。

3.4 丹參莖葉酚酸組分對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度及TNF-α、IL-6和IL-4水平的影響模型組小鼠腸管長(zhǎng)度明顯短于正常對(duì)照組(P<0.01)且IL-6、IL-4、TNF-α水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01,P<0.05)。給藥干預(yù)后，各給藥組不同程度的改善結(jié)腸短縮及IL-6水平，對(duì)IL-4和TNF-α水平無(wú)明顯抑制作用。在各給藥組中，除DGSAH、DGSAL及SABH外其他給藥組結(jié)腸長(zhǎng)度均明顯增長(zhǎng)(P<0.05)，尤以DYSAL和S+RL組小鼠結(jié)腸平均長(zhǎng)度最長(zhǎng)，明顯長(zhǎng)于模型組(P<0.01)。SABH組治療后IL-6水平明顯降低(P<0.01)，此外SASP、S+RL和RAL組治療后也明顯降低IL-6含量(P<0.05)，見Fig 2A～B、Fig 2C～E。

3.5 丹參莖葉酚酸組分對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠結(jié)腸的炎性因子mRNA表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織IL-6、COX2、IL-17A mRNA水平明顯升高(P<0.01)。給藥干預(yù)后，各給藥組均不同程度的降低COX2和IL-17A mRNA水平，其中DYSAH、SABH、RAL、S+RL組能明顯下調(diào)IL-6、COX2、IL-17A mRNA表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。總體上，相比于DYSA，SAB和RA單獨(dú)或混合表現(xiàn)出對(duì)IL-6、COX2和IL-17A mRNA更為明顯的抑制作用，見Fig 3。

Fig 2 (A～B) Effect on colon length of UC mice;(C～E)Changes of IL-6,TNF-α and IL-4 levels in colon tissues of UC

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

4 討論

UC的復(fù)雜病因尚未完全明確，已知受損的腸上皮組織和活化的免疫細(xì)胞參與粘膜和粘膜下層炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的持續(xù)過度產(chǎn)生及炎癥相關(guān)蛋白的上調(diào)(如COX2)從而導(dǎo)致細(xì)胞因子平衡紊亂是UC發(fā)病機(jī)制的重要原因[8]。COX2為一種常見的誘導(dǎo)酶，在病理狀態(tài)下誘導(dǎo)組織將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為過量前列腺素，促使各種炎癥反應(yīng)。文獻(xiàn)研究表明，UC的發(fā)病與COX2密切相關(guān)，并且病情越嚴(yán)重COX2表達(dá)水平越高[9]。對(duì)COX2的抑制可降低中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕炎癥反應(yīng)，從而緩解UC的發(fā)生發(fā)展[10]。據(jù)報(bào)道，迷迭香酸能夠有效抑制NF-κB和STAT3的活化，降低促炎因子(TNF-α、IL-6等)及COX2的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，改善DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠病理表現(xiàn)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參莖葉總酚酸及其主要效應(yīng)成分丹酚酸B和迷迭香酸對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠結(jié)腸組織中COX2 mRNA均表現(xiàn)出抑制作用。

Fig 3 Changes of IL-6, COX2 and IL-17A mRNAin colon tissues of UC

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Lin等[11]發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)STAT3依賴性的激活COX2轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量前列腺素可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化。除此之外，IL-6在早期階段就可以協(xié)同TGF-β誘導(dǎo)Th17細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在IBD發(fā)展中的關(guān)鍵作用，是研究治療IBD的新方向[12]。UC患者腸道大量浸潤(rùn)的Th17細(xì)胞主要表達(dá)IL-17A等，作用于中性粒細(xì)胞，刺激炎癥介質(zhì)等分泌，加速中性粒細(xì)胞的募集、活化、遷移至病灶，進(jìn)而加速炎癥進(jìn)程和引起腸黏膜損傷[13-14]。主要含迷迭香酸的紫蘇提取物可抑制血清中IL-17A等的表達(dá)，達(dá)到對(duì)UC模型小鼠的保護(hù)作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸、丹酚酸B單獨(dú)或混合使用可明顯降低DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠結(jié)腸組織中的IL-6水平和IL-6、IL-17A mRNA表達(dá)；丹參莖葉總酚酸能夠降低IL-6含量，雖差異無(wú)顯著性，但能明顯抑制IL-6、IL-17A mRNA表達(dá)。

本文研究表明，丹參莖葉總酚酸及其主要效應(yīng)成分丹酚酸B和迷迭香酸單獨(dú)或混合均不同程度的改善DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠的病理表現(xiàn)可能與下調(diào)IL-6蛋白及mRNA水平，抑制COX2、IL-17A mRNA表達(dá)，從而直接或間接影響IL-17A的分泌和Th17細(xì)胞的分化，緩解UC的發(fā)生發(fā)展，為丹參莖葉防治UC的進(jìn)一步深入研究和丹參莖葉的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。