好氧顆粒污泥胞外聚合物組分特征分析

王玉瑩，支麗玲，馬鑫欣，王 碩,2,3，李 激,2,3

(1.江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2.江蘇省厭氧生物技術(shù)重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫 214122；3.江蘇省高校水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 蘇州 215009)

好氧顆粒污泥(AGS)技術(shù)作為一種新型的污水處理方法，在小試和中式裝置中已被廣泛研究，部分地區(qū)嘗試將該技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)印染廢水、含核廢料廢水的處理中，目前已取得顯著成果[1-3].胞外聚合物(EPS)是AGS的重要組成部分，由微生物生長代謝的分泌物、細(xì)胞裂解產(chǎn)物和吸附的小分子化合物組成，成分復(fù)雜，主要特征物質(zhì)包括蛋白質(zhì)(protein, PN)和多糖(polysaccharide, PS)類以及少量的腐殖酸、富里酸和核酸類物質(zhì)[4-5]，具有良好的絮凝性，Nielsen等[6]證明了EPS是促進(jìn)AGS形成并提高AGS穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素.

按照組分和形態(tài)的不同，EPS可分為松散型胞外聚合物(soluble microbial products-EPS, SMP-EPS)、附著型胞外聚合物(loosely bound-EPS, LB-EPS)和緊密結(jié)合型胞外聚合物(tightly bound-EPS, TB-EPS)[7].Liao等[8]研究發(fā)現(xiàn)，EPS的組分和質(zhì)量分?jǐn)?shù)會對微生物絮凝、污泥沉降性和脫水性產(chǎn)生影響.TB-EPS中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加會促進(jìn)AGS的形成，LB-EPS中的某些蛋白質(zhì)會影響污泥的電負(fù)性和脫水性[9].Tay等[10]認(rèn)為TB-EPS中β-多糖可提高微生物間的黏附力，強(qiáng)化AGS結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.Adav等也發(fā)現(xiàn)不溶性多糖是AGS的支撐結(jié)構(gòu)，可保證AGS具有較高的強(qiáng)度[1].相反，Liu等[7]認(rèn)為污泥中的非細(xì)胞蛋白質(zhì)核心為AGS穩(wěn)定運行提供了骨架結(jié)構(gòu).因此，深入解析EPS不同組分的功能作用，有助于推動AGS技術(shù)的發(fā)展.目前，國內(nèi)外針對EPS在AGS形成與穩(wěn)定過程中的作用研究已經(jīng)較多，但缺乏對EPS中功能組分和特性變化的詳盡解析，限制了AGS技術(shù)的發(fā)展.

本文以接種污泥、實驗室培養(yǎng)的好氧顆粒污泥(AGS-laboratory, AGS-LAB)和污水處理廠培養(yǎng)的好氧顆粒污泥(AGS-wastewater treatment plant, AGS-WWTP)為研究對象，通過傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)和三維熒光光譜(excitation-emission-matrix spectra, 3D-EEM)等技術(shù)對AGS形成過程中污泥EPS的組成成分和特性進(jìn)行相關(guān)分析，旨在研究污泥顆粒化過程中EPS 不同組分的變化特征，以期為AGS技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供理論支撐.

1 實 驗

1.1 實驗裝置

實驗室和污水處理廠實驗反應(yīng)裝置均采用有機(jī)玻璃制成的圓柱形SBR，前者高100 cm，內(nèi)徑8 cm，有效容積約為4 L；后者高60 cm，內(nèi)徑30 cm，有效容積約為42 L.反應(yīng)器底部均裝有曝氣系統(tǒng)，曝氣量大小由轉(zhuǎn)子流量計控制，充氧期間溶解氧控制在5～8 mg/L.運行周期4 h，其中進(jìn)水60 min、曝氣時間由145 min逐漸增加到170 min，沉降時間由30 min逐漸降低到5 min.污泥泥齡20 d.

1.2 接種污泥與進(jìn)水水質(zhì)

接種污泥取自無錫市某污水處理廠好氧池活性污泥，外表呈黃褐色，較為松散.實驗室運行反應(yīng)器進(jìn)水采用人工配水，以CH3COONa為碳源，NH4Cl 為氮源，K2HPO4為磷源，單位MLSS進(jìn)水污泥COD負(fù)荷為0.39 kg/(kg·d).此外，還添加了少量的微量元素，以保證細(xì)菌正常的生長代謝活動.污水處理廠運行反應(yīng)器進(jìn)水為旋流沉砂池出水，大部分為生活污水，含有少量工業(yè)廢水，進(jìn)水污泥負(fù)荷平均為0.18 kg/(kg·d)，水質(zhì)波動較大.

1.3 分析方法

1.3.1 胞外聚合物和生物量的測定

EPS的提取采用NaOH法[11]，首先將10 mL待測樣品置于50 mL離心管中，超聲解體，分別在2 000，5 000和10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min，收集上清液，即為SMP-EPS、LB-EPS和TB-EPS.用考馬斯亮藍(lán)法和蒽酮-硫酸比色法對EPS中蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定[9].

1.3.2 FTIR特性分析[12]

采用IRTrace-100型傅里葉變換紅外光譜儀(IRTrace，日本島津)對樣品進(jìn)行官能團(tuán)鑒定.具體操作方法如下：首先將污泥EPS樣品置于LABCONCO凍干機(jī)上進(jìn)行凍干處理，將處理好的樣品粉末和KBr以合適的比例混合后在研磨機(jī)上研磨，使用壓片機(jī)壓片并用紅外光譜儀進(jìn)行光譜掃描.

1.3.3 三維熒光特性分析[13]

首先將待測樣品置于島津總有機(jī)碳分析儀上檢測DOC質(zhì)量濃度，若DOC質(zhì)量濃度太高，可用去離子水稀釋直到DOC質(zhì)量濃度低于10 mg/L，采用日立F7000熒光分光光度計進(jìn)行三維熒光(日立F7000，日本日立)測試.本實驗以10 nm為增量，激發(fā)波長從200 nm掃描至400 nm，發(fā)射波長從280 nm掃描至500 nm，掃描速度為12 000 nm/min.

1.3.4 水解氨基酸測試方法

取污泥EPS樣品約1 mL，先加入1 mL濃鹽酸，再加7 mL的HCl溶液(6 mol/L)，充氮氣后封管，在烘箱內(nèi)120 ℃水解22 h；再加入4.8 mL的NaOH溶液(10 mol/L)中和，在25 mL容量瓶中定容，用濾紙過濾、離心；取400 μL澄清樣品置于樣品瓶，最后通過Agilent1260高效液相色譜儀(Agilent1260，美國)測定.

1.3.5 GC-MS分析[14]

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)(QP2010Ultra，日本島津)可對有機(jī)物進(jìn)行定性和定量分析.通過HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品的pH，分別對EPS中的中性、酸性和堿性有機(jī)物進(jìn)行萃取，最后通過QP2010Ultra GC-MS對有機(jī)物鑒定.

2 結(jié)果與討論

2.1 EPS變化

2.1.1 EPS組分變化特征

具有黏附特性的EPS可促進(jìn)微生物絮凝，縮短污泥顆粒化進(jìn)程，并提高AGS結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[15].此外，蛋白質(zhì)和多糖比例(PN與PS比)變化會影響污泥表面的親疏水性、帶電性和微生物群落結(jié)構(gòu)的完整性[16].AGS-LAB中EPS的變化如圖1(a)所示，在接種污泥顆粒化過程中，EPS迅速增長，由接種污泥的84.36 mg/g增加到AGS-LAB的106.47 mg/g，以蛋白質(zhì)增加為主，表明蛋白質(zhì)在污泥顆?；^程中發(fā)揮重要作用.AGS-LAB的EPS中多糖維持在18.8 mg/g左右，變化較小；PN與PS比呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，由接種污泥的4.27上升到AGS-LAB的6.65，PN與PS比的增加表明AGS-LAB中EPS疏水性提高，相應(yīng)污泥表面的 Gibbs 自由能下降[17]，污泥之間的黏附性提高，有利于保持AGS緊密的內(nèi)部結(jié)構(gòu).

AGS-WWTP的EPS變化如圖1(b)所示，EPS呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，反應(yīng)器運行至30 d時、單位MLVSS EPS質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大153.22 mg/g， 60 d時下降到128.23 mg/g，而EPS的變化以蛋白質(zhì)為主.通過水質(zhì)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)器運行至30 d時污水處理廠工業(yè)廢水受納增多，該水質(zhì)對AGS-WWTP沖擊較大，污泥微生物為提高自身穩(wěn)定性，會分泌大量蛋白質(zhì)抵抗外界不良環(huán)境，這是該階段蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的原因之一[18].當(dāng)進(jìn)水恢復(fù)穩(wěn)定后，污泥微生物對蛋白質(zhì)的需求下降，因此,蛋白質(zhì)的合成量降低.EPS中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化較小，基本維持在15.9 mg/g，與圖1(a)中多糖變化相似，該現(xiàn)象與Zhu等[17]研究一致，這是因為多糖中含有羧基等親水性帶負(fù)電荷基團(tuán)，該物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)適中時，可吸附水中游離的微小絮體，促進(jìn)AGS的形成，質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高則容易影響污泥絮體的穩(wěn)定性，導(dǎo)致AGS解體，因此,EPS中的多糖在相對穩(wěn)定的范圍內(nèi)波動.AGS-WWTP在顆粒化過程中PN與PS比也呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，由接種污泥的4.27上升到AGS的7.54，略高于圖1(a)中AGS-LAB的6.65，推測與污水處理廠進(jìn)水水質(zhì)復(fù)雜有關(guān).

2.1.2 EPS黏附性分級組分特征

AGS-LAB中各層蛋白質(zhì)和多糖的變化如圖2(a),(b)所示，蛋白質(zhì)以TB-EPS層增加為主，由接種污泥的50.46 mg/g增加到AGS-LAB的83.14 mg/g，SMP-EPS和LB-EPS層蛋白質(zhì)增量較小.SMP-EPS和LB-EPS層蛋白質(zhì)位于微生物體的外側(cè)，結(jié)構(gòu)比較疏松，含水率較高，具有流變特性[19]，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高容易導(dǎo)致AGS絮體化，使SVI值增大，進(jìn)而導(dǎo)致AGS解體.TB-EPS層蛋白質(zhì)分子排列密集，與細(xì)胞結(jié)合最緊密，可中和污泥中帶負(fù)電荷的官能團(tuán)，降低污泥的電負(fù)性，促進(jìn)AGS的形成[20].多糖以SMP-EPS和TB-EPS層變化為主，SMP-EPS層多糖由接種污泥的3.04 mg/g增加到AGS-LAB的7.02 mg/g，該層多糖可通過離子鍵使細(xì)胞發(fā)生絮凝[21]，促進(jìn)微生物聚集體的形成.TB-EPS層多糖由7.4 mg/g上升到10.2 mg/g，Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn)，TB-EPS中β-多糖是構(gòu)成AGS結(jié)構(gòu)的骨架，該物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高可為AGS的穩(wěn)定運行奠定基礎(chǔ).

圖1 污泥顆?；^程中胞外聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

AGS-WWTP中各層蛋白質(zhì)和多糖的變化如圖2(c),(d)所示，蛋白質(zhì)以TB-EPS層增加為主，由接種污泥的50.46 mg/g增加到AGS-WWTP的103 mg/g，其增量大于AGS-LAB.SMP-EPS中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化與圖2(a)中相似，LB-EPS中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降，可能與進(jìn)水水質(zhì)有關(guān).圖2(d)中多糖的變化與圖2(b)中具有很大差異，SMP-EPS和LB-EPS中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)皆呈遞減狀態(tài)，這與進(jìn)水中有機(jī)物匱乏有關(guān)，處于易脫落位置的SMP-EPS和LB-EPS中多糖被AGS-WWTP作為碳源利用.TB-EPS層多糖總體呈現(xiàn)上升趨勢，有研究發(fā)現(xiàn)，TB-EPS中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加可提高污泥的抗沖擊負(fù)荷和抗毒性沖擊能力，該變化可以很好地適應(yīng)污水處理廠的進(jìn)水水質(zhì)[23].

圖2 污泥顆?；^程各層蛋白質(zhì)和多糖的變化

2.2 FTIR光譜分析

圖3 接種污泥和好氧顆粒污泥中EPS的3D-EEM圖譜

2.3 三維熒光光譜分析

接種污泥、AGS-LAB和AGS-WWTP中SMP-EPS、LB-EPS和TB-EPS的三維熒光光譜如圖4所示，每個污泥樣品中都存在4個峰，其中峰A(λEx/λEm=220～250/280～330)和峰B(λEx/λEm=220～250/330～380)分別為芳香族蛋白類物質(zhì)和酪氨酸/色氨酸類蛋白；峰C(λEx/λEm=280～310/380～455)為類富里酸；峰D(λEx/λEm=300～330/360～390)為多糖區(qū).由圖4(a),(d)和(g)可知，AGS中峰A和峰B的熒光強(qiáng)度皆高于接種污泥，說明在接種污泥顆?；^程中SMP-EPS中蛋白質(zhì)的增長主要以芳香族蛋白質(zhì)類物質(zhì)和酪氨酸/色氨酸類蛋白質(zhì)為主，Dong等[31]推測酪氨酸蛋白是AGS的重要結(jié)構(gòu)組分，會促進(jìn)接種污泥顆?；?此外，色氨酸類蛋白與EPS中的芳環(huán)氨基酸結(jié)構(gòu)有關(guān)[32]，是一種疏水性物質(zhì)，可提高AGS結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這與2.2傅里葉紅外中2 929 cm-1吸收峰的變化具有良好對應(yīng)關(guān)系.由圖4(b)、(e)和(h)中可知，3種污泥樣品都存在芳香族蛋白類物質(zhì)(峰A)，唯有AGS-LAB存在酪氨酸/色氨酸類蛋白(峰B)，這可能是因為污水處理廠進(jìn)水水質(zhì)復(fù)雜，對污泥中微生物群落的沖擊較大，某些有毒有害物質(zhì)抑制了細(xì)菌的代謝活動，造成相關(guān)蛋白質(zhì)的合成量降低，此結(jié)果也與圖2(c)中測得LB-EPS蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降相符.由圖4(c),(f)和(i)可知，3種污泥樣品TB-EPS中都存在峰B、峰C和峰D，只是峰的強(qiáng)度存在差異.其中，類富里酸(峰C)在接種污泥和AGS-WWTP中強(qiáng)度較低，這與進(jìn)水水質(zhì)復(fù)雜存在一定關(guān)系[33].TB-EPS中多糖區(qū)物質(zhì)主要是指β-多糖，接種污泥和AGS-WWTP中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的原因可能與微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異有關(guān)[34].

(a)～(c)接種污泥；(d)～(f)AGS-LAB;(g)～(i)AGS-WWTP;(a),(d),(g)SMP-EPS；(b),(e),(h)LB-EPS;(c),(f),(i)TB-EPS

2.4 水解氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和種類分析

EPS中水解氨基酸的種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以反映污泥的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性[35].Miller等[36]認(rèn)為某些氨基酸能夠影響細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)和多肽類物質(zhì)的合成.Anfora[37]研究發(fā)現(xiàn)大部分功能性細(xì)菌可以合成右旋類氨基酸，該物質(zhì)可以發(fā)揮信號分子的作用調(diào)節(jié)微生物群體行為，進(jìn)而促進(jìn)絮狀污泥顆?；⒕S持AGS結(jié)構(gòu)穩(wěn)定.由表1可知，親水性氨基酸如絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸在污泥樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低，這有利于促進(jìn)AGS的形成.AGS-LAB中半胱氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.18 mg/g，略高于另外兩種污泥樣品，Liao等[8]發(fā)現(xiàn)，通過二硫鍵連接的半胱氨酸分子，在某些部位適當(dāng)提高其質(zhì)量分?jǐn)?shù)會加強(qiáng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性.丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸屬于疏水性氨基酸，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在AGS樣品中相對較高，EPS疏水性的提高可增強(qiáng)污泥微生物間的黏附力，為絮狀污泥的顆粒化提供物質(zhì)基礎(chǔ)[38].此外，組氨酸、精氨酸和賴氨酸在AGS-LAB和AGS-WWTP中分別升高56.88%和137.68%、17.09%和67.4%以及60.88%和20.23%.這3種物質(zhì)屬于堿性氨基酸，帶有正電荷，可降低細(xì)胞表面負(fù)電荷，減少微生物間靜電斥力，加強(qiáng)污泥表面的疏水性以及保持AGS的結(jié)構(gòu)完整性[39].同時，氨基酸總量由接種污泥的177.16 mg/g分別升高到AGS-LAB和AGS-WWTP的218.64和235.98 mg/g，氨基酸總量的升高也為AGS的形成奠定物質(zhì)基礎(chǔ).

表1 EPS中水解氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和種類分析

Tab.1 Analysis of contents and species of hydrolyzed amino acids in EPS mg·g-1

2.5 有機(jī)組分分析

表2 EPS中有機(jī)組分分析(以峰面積計)

3 結(jié) 論

1)在接種污泥顆?；陂g，EPS中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯提高，以TB-EPS層增加為主，由AS-WWTP的50.46 mg/g分別增加到AGS-LAB的83.14 mg/g和AGS-WWTP的102.99 mg/g.

2)光譜分析結(jié)果表明，兩種AGS的EPS中芳香族氨基酸、色氨酸/酪氨酸和天冬氨酸蛋白吸收峰強(qiáng)度明顯提高，該部分蛋白質(zhì)為AGS的形成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ).

3)與接種污泥相比，兩種AGS的EPS中含有較多疏水性氨基酸，帶正電荷的堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)增幅較大，氨基酸總量平均提高50.15 mg/g.

4)兩種AGS的EPS中存在苯丙胺、羥基脲、二乙烯苯和十六甲基環(huán)八硅氧烷4種特有有機(jī)組分，推測該部分有機(jī)組分有助于縮短接種污泥顆?；M(jìn)程，提高AGS結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.