Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值

熊夢(mèng)園，方芳，李一榮

武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430071

結(jié)核病 (tuberculosis) 是由結(jié)核分枝桿菌 (M.tuberculosis) 引起的慢性傳染病，可侵犯人體全身多種器官，但其主要侵犯肺臟，引起肺結(jié)核 (pulmonary tuberculosis，PTB) ，常以乏力、咳嗽、咯血、低熱、盜汗等為主要臨床表現(xiàn)[1]。據(jù)報(bào)道，全球約有20 億結(jié)核感染者，且感染人數(shù)仍在逐年增長(zhǎng)。2017年全球新發(fā)結(jié)核患者數(shù)超過1 000萬，其中男性580萬、女性320萬、兒童100 萬，大約9%發(fā)生在艾滋病病毒 (HIV) 感染者中。當(dāng)結(jié)核病被及早發(fā)現(xiàn)并得到有效治療時(shí)，基本上是可以治愈的。然而，2017 年全球共有約160 萬人死于結(jié)核病，其中包括30 萬HIV 患者[2]。目前我國是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，每年新發(fā)結(jié)核患者數(shù)約130萬，所面臨的結(jié)核防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻[3]。鑒于結(jié)核病的高患病率、高死亡率及其傳染性，早期、快速、準(zhǔn)確的診斷是預(yù)防和治療結(jié)核病的一項(xiàng)重要因素。Xpert MTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)是由美國Cepheid 公司研發(fā)的一種結(jié)核桿菌快速檢測(cè)技術(shù)，可集樣本前處理、DNA自動(dòng)提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR) 于一體，不僅能明確樣本中是否存在結(jié)核分枝桿菌的DNA，而且能明確其是否對(duì)利福平耐藥[4]。Xpert MTB/RIF 檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，僅需少量步驟的準(zhǔn)備工作，2 h 內(nèi)能同時(shí)報(bào)告結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性，相比于涂片鏡檢 (1 d) 、固體培養(yǎng) (30 d) 、液體培養(yǎng) (16 d) 等傳統(tǒng)方法大幅度縮短了啟動(dòng)治療的時(shí)間[5]。世界衛(wèi)生組織 (WHO) 于2010年正式推薦Xpert MTB/RIF用于成人肺結(jié)核的診斷，并于2013年推薦其用于診斷兒童肺結(jié)核和特定形式的肺外結(jié)核[6]。本研究以臨床最終診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，并與涂片抗酸染色鏡檢及γ-干擾素釋放試驗(yàn) (IGRA) 進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)Xpert MTB/RIF對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值，以期為此技術(shù)在我國的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年9 月至2019 年7 月于武漢大學(xué)中南醫(yī)院因疑似肺結(jié)核就診的765例患者作為研究對(duì)象，其中男性506例，女性259例，年齡12～100 歲，平均 (56.98±17.37) 歲。共收集到428 份痰液、263 份肺泡灌洗液及74 份胸水，分別進(jìn)行涂片抗酸染色和Xpert MTB/RIF 檢測(cè)，同時(shí)采集到237 例患者的靜脈血，用于進(jìn)行γ-干擾素釋放試驗(yàn)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 涂片抗酸染色與鏡檢 痰標(biāo)本的涂片抗酸染色與鏡檢依據(jù)《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》進(jìn)行[7]。肺泡灌洗液及胸水在涂片前先離心富集，棄去上清液，吸取底部液體涂片，其余步驟與痰涂片鏡檢相同。

1.2.2 Xpert MTB/RIF檢測(cè) 765例患者的痰、肺泡灌洗液及胸水標(biāo)本在進(jìn)行Xpert MTB/RIF檢測(cè)前，按以下方式進(jìn)行預(yù)處理：對(duì)于痰標(biāo)本，取1 mL痰標(biāo)本加入2 mL樣本處理液，渦旋震蕩10 s，室溫放置10 min，重復(fù)震蕩步驟，室溫放置5 min后，取2 mL經(jīng)過處理的標(biāo)本加入Xpert MTB/RIF試劑盒，上機(jī)檢測(cè)；對(duì)于肺泡灌洗液及胸水，首先3 000 r/min 離心10 min，吸棄上清，加入2 mL 樣本處理液，渦旋震蕩10 s，充分混勻后加入Xpert MTB/RIF試劑盒，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 γ-干擾素釋放試驗(yàn) (IGRA) 采用靜脈穿刺術(shù)采集3 mL全血樣本，分裝到陰性對(duì)照 (N) 、陽性對(duì)照 (P) 和檢測(cè) (T) 三種含有刺激抗原的培養(yǎng)管中，每管1 mL。檢測(cè)試劑盒來自海口維瑅生物研究院，實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)說明書進(jìn)行。分別讀取N、P、T 反應(yīng)的OD 值，計(jì)算出T-N、P-N和 (T-N) / (P-N) 的值，當(dāng)N＜0.5時(shí)，T-N/P-N≥0.16將結(jié)果判定為陽性，T-N/P-N＜0.16則將結(jié)果判定為陰性；當(dāng)0.5≤N＜2.5 時(shí)，T-N≥1.5 將結(jié)果判定為陽性，T-N＜1.5 則將結(jié)果判定為陰性；當(dāng)N≥2.5 時(shí)，判為無法確定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。判斷各檢驗(yàn)方法與臨床診斷結(jié)果的一致性采用Kappa檢驗(yàn)，K＜0.4為一致性差，0.40≤K＜0.75 表示一致性較好，K≥0.75 為一致性極好。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，765 例疑似肺結(jié)核病患者中，共有195例最終確診為肺結(jié)核，其中男性136 例，女性59 例；平均 (58.75±16.84) 歲；原發(fā)性肺結(jié)核60 例，血行播散性肺結(jié)核3 例，繼發(fā)性肺結(jié)核87 例，氣管、支氣管結(jié)核13 例及結(jié)核性胸膜炎32例，同時(shí)有31 例患者伴有HIV 感染。570 例患者排除結(jié)核感染，其中男性370 例，女性200 例；平均 (57.43±17.33) 歲；肺炎226例，支氣管擴(kuò)張伴感染136例，肺癌62 例，慢性阻塞性肺疾病36 例及其他感染110 例，其中55 例患者同時(shí)合并HIV 感染。兩組患者性別與年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05) 。

2.2 Xpert MTB/RIF 與涂片鏡檢檢測(cè)結(jié)果 以臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF 與涂片抗酸染色鏡檢檢測(cè)的陽性檢出率、對(duì)肺結(jié)核診斷的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測(cè)值 (PPV) 、陰性預(yù)測(cè)值 (NPV) 、準(zhǔn)確度及與臨床檢驗(yàn)診斷結(jié)果的一致性見表1。χ2檢驗(yàn)表明，Xpert MTB/RIF 對(duì)肺結(jié)核的陽性檢出率、靈敏度、準(zhǔn)確度及陰性預(yù)測(cè)值明顯高于涂片抗酸染色鏡檢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05) 。Kappa檢驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于與臨床診斷結(jié)果的一致性，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)優(yōu)于涂片鏡檢，K 值分別為0.628和0.173。另外，Xpert MTB/RIF 同時(shí)可測(cè)得利福平耐藥性檢出率為6.25% (7/112) 。

表1 Xpert MTB/RIF與涂片鏡檢的檢測(cè)結(jié)果比較[% (比值) ]

2.3 IGRA 檢測(cè)與Xpert MTB/RIF 聯(lián)合IGRA 檢測(cè)結(jié)果比較 本研究中有237例患者在行Xpert MTB/RIF檢測(cè)的同時(shí)進(jìn)行了IGRA檢測(cè)，兩者任一結(jié)果為陽性則判定為聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果陽性。根據(jù)臨床診斷結(jié)果，79 例確診為肺結(jié)核，其中男性57 例，女性22 例；平均 (56.76±17.46) 歲。158例排除肺結(jié)核，其中男性113例，女性45例；平均 (55.52±18.63) 歲。兩組患者性別與年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05) 。IGRA 及Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果見表2，兩者的靈敏度及特異度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05) 。但與單獨(dú)IGRA檢測(cè)和單獨(dú)Xpert MTB/RIF檢測(cè)相比，兩者聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度顯著提高，特異度有所下降 (P＜0.05) 。兩者與臨床診斷結(jié)果的一致性相似，K值分別為0.529和0.546，兩者聯(lián)合檢測(cè)一致性略有提高，K值為0.692。

表2 IGRA檢測(cè)與及Xpert MTB/RIF聯(lián)合IGRA檢測(cè)結(jié)果比較[% (比值) ]

2.4 合并感染HIV者Xpert MTB/RIF與IGRA檢測(cè)結(jié)果比較 本研究共納入86 例HIV 患者，其中31例確診同時(shí)感染肺結(jié)核，對(duì)于此類患者，Xpert MTB/RIF 對(duì)肺結(jié)核診斷的靈敏度、特異度、PPV、NPV 分別為41.94% (13/31) 、100.00% (55/55) 、100.00% (13/13) 、75.34% (55/73) 。IGRA 對(duì)肺結(jié)核診斷的靈敏度、特異度、PPV、NPV 分別為45.16% (14/31) 、92.73% (51/55) 、77.78% (14/18) 、75.00% (51/68) 。 HIV 組 中Xpert MTB/RIF檢測(cè)與IGRA的靈敏度、特異度、PPV及NPV比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05) 。

2.5 Xpert MTB/RIF對(duì)不同類型的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果比較 按標(biāo)本類型分類，可將標(biāo)本分為痰組、肺泡灌洗液組及胸水組，各組Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果如表3所示。χ2檢驗(yàn)表明，三組不同類型的標(biāo)本陽性檢出率、靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值及準(zhǔn)確度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05) ，痰組與肺泡灌洗液組陽性檢出率靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值及準(zhǔn)確度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05) ，但均與胸水組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05) 。痰組、肺泡灌洗液組與臨床診斷結(jié)果一致性較好，遠(yuǎn)高于胸水組 (K值分別為0.624、0.728和0.252) 。

表3 不同類型的標(biāo)本Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果[% (比值) ]

3 討論

早期快速、準(zhǔn)確地診斷肺結(jié)核 (包括涂片陰性肺結(jié)核和耐藥結(jié)核) 對(duì)于改善患者預(yù)后，減少結(jié)核病傳播、降低結(jié)核病死亡率、減輕患者和社會(huì)負(fù)擔(dān)等多個(gè)方面至關(guān)重要，是完成世界衛(wèi)生組織 (WHO) “終結(jié)結(jié)核病戰(zhàn)略”的戰(zhàn)略基礎(chǔ)[8]?，F(xiàn)有的臨床診斷方法中，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)通常被認(rèn)為是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，并且是檢測(cè)結(jié)核桿菌耐藥性的關(guān)鍵步驟。然而，結(jié)核桿菌培養(yǎng)是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜和緩慢的過程，固體培養(yǎng)通常需要1～2個(gè)月的時(shí)間才能得到結(jié)果，液體培養(yǎng)雖然比固體培養(yǎng)更敏感和快速，但仍需要2個(gè)星期以上，而且臨床上菌陰結(jié)核較為常見；血清學(xué)診斷多受抗原純度和特異性影響。隨著近年來現(xiàn)代化科技水平的不斷提高，新型分子診斷技術(shù)層出不窮，Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)以其操作簡(jiǎn)便、快速等諸多優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。

Xpert MTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)同時(shí)采用6 種分子探針及6種分子信標(biāo)，選擇性的覆蓋rpoB基因上81 bp的利福平耐藥決定區(qū)，檢測(cè)是否結(jié)核桿菌感染及其利福平耐藥性。研究表明，rpoB基因突變存在于95%以上的利福平耐藥菌株株，因此，可選擇rpoB基因作為檢測(cè)利福平耐藥性的相關(guān)基因[9-10]。Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)集標(biāo)本處理、DNA提取、基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增和熒光檢測(cè)于一體，操作簡(jiǎn)單便捷，并且過程中不容易產(chǎn)生氣溶膠污染，從而可降低結(jié)核桿菌生物危害的風(fēng)險(xiǎn)。獨(dú)立包裝的檢測(cè)試劑盒也減少了DNA污染的機(jī)會(huì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全和環(huán)境要求較低，需要的生物安全防護(hù)級(jí)別與直接涂片鏡檢相當(dāng)，對(duì)操作人員要求也較低，可逐步推廣用于POCT檢測(cè)[11]及我國基層醫(yī)院[12]。

本研究中，共有195 例患者確診為肺結(jié)核，占25.49%，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)陽性檢出率為14.64%、診斷靈敏度、NPV 和準(zhǔn)確度分別為54.87%、86.52%和87.84%，均顯著高于涂片抗酸染色鏡檢，其與臨床診斷結(jié)果一致性也遠(yuǎn)高于涂片鏡檢，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)特異度、PPV 大于95%，說明臨床上開展Xpert MTB/RIF檢測(cè)，可幫助臨床實(shí)現(xiàn)快速、較準(zhǔn)確的診斷，減少漏診和誤診。但與其他研究[13]相比，本研究中Xpert MTB/RIF靈敏度、PPV較低，可能與不同地區(qū)結(jié)核病患病率不同有關(guān)。本次研究肺結(jié)核患者占比不高，也可能與標(biāo)本取材、樣本前處理等有關(guān)。研究表明，痰涂片鏡檢及Xpert MTB/RIF 的檢出性能很大程度上受標(biāo)本質(zhì)量的影響[14-15]，臨床上患者經(jīng)常出現(xiàn)少痰、無力咳痰或痰標(biāo)本不合格的情況，痰液含菌量較少，無法達(dá)到檢測(cè)限。臨床醫(yī)生留痰時(shí)應(yīng)向患者講解留取痰標(biāo)本的重要性及如何從肺部深處咳痰，注意不要留取到鼻腔或咽部分泌物等。此外，咯血是肺結(jié)核常見臨床表現(xiàn)之一，痰液中的紅細(xì)胞可以抑制PCR反應(yīng)，對(duì)于此種標(biāo)本，應(yīng)進(jìn)行預(yù)先處理，盡可能去除痰中混有的紅細(xì)胞。Xpert MTB/RIF對(duì)不同標(biāo)本檢出效率有所不同，綜合分析，肺泡灌洗液檢出效能最佳，痰液次之，胸水檢出效果不佳，與另一項(xiàng)研究結(jié)果[16]相符。痰樣本陽性檢出受限于病變部位、樣本質(zhì)量等多個(gè)因素，肺泡灌洗液則是通過支氣管鏡直接留取病變部位灌洗液進(jìn)行檢測(cè)，并且肺內(nèi)各葉、段均可使用，擴(kuò)大了檢查范圍，結(jié)核桿菌載量較高，因此檢出陽性率較高。THERON等[17]對(duì)南非單中心154例疑似肺結(jié)核患者進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性研究，對(duì)采集的肺泡灌洗液行Xpert MTB/RIF 檢測(cè)，以培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，其靈敏度、特異度分別為92.6%、96.0%，遠(yuǎn)高于涂片鏡檢?？梢妼?duì)于需要支氣管鏡檢查的疑似結(jié)核病或少痰患者，可同時(shí)采集其肺泡灌洗液行Xpert MTB/RIF 檢測(cè)，檢測(cè)前對(duì)肺泡灌洗液進(jìn)行離心富集會(huì)大大提高其陽性檢出率。結(jié)核性胸膜炎是結(jié)核桿菌直接感染或胸膜對(duì)結(jié)核桿菌菌體成分產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)而發(fā)生的炎癥，歸為Ⅴ型肺結(jié)核，患者常出現(xiàn)胸腔積液。本研究中，胸水組Xpert MTB/RIF 檢測(cè)敏感度僅為19.05%，遠(yuǎn)低于痰組及肺泡灌洗液組，其特異度及陽性預(yù)測(cè)值均為100.00%，證明該方法對(duì)結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值有限。SEHGAL等[18]針對(duì)結(jié)核性胸膜炎的Meta分析也證明了這一點(diǎn)，其原因可能是胸腔積液中結(jié)核桿菌載量較低，難以達(dá)到檢測(cè)限。WHO 不推薦胸水作為病原學(xué)證據(jù)確診結(jié)核性胸膜炎，應(yīng)首選胸膜活組織。此外，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)僅針對(duì)結(jié)核桿菌的DNA，無法分辨細(xì)菌存活狀態(tài)，在部分陳舊性肺結(jié)核中，也可能檢測(cè)到結(jié)核桿菌DNA。因此，診斷陽性患者還要結(jié)合臨床及其他相關(guān)檢查來判斷肺結(jié)核的活動(dòng)性。

γ-干擾素釋放試驗(yàn)是一項(xiàng)特異性T淋巴細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)，不受卡介苗接種和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌的干擾，已被廣泛應(yīng)用于臨床，輔助診斷結(jié)核感染[19]。相比于單獨(dú)檢測(cè)，Xpert MTB/RIF及IGRA聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度明顯提高。肺結(jié)核是HIV 患者最常見的機(jī)會(huì)性感染之一，對(duì)于此類患者，早期診斷尤為重要。本研究中包括86例HIV患者，確診為肺結(jié)核的有31例，但Xpert MTB/RIF檢測(cè)對(duì)其診斷價(jià)值有限，且與IGRA檢測(cè)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能原因是樣本量太小，不具有廣泛的代表性，也可能是HIV患者免疫功能降低干擾檢測(cè)效能。研究表明，大約90%的耐利福平結(jié)核桿菌也可能對(duì)異煙肼耐藥，因此檢測(cè)結(jié)核桿菌對(duì)利福平的耐藥性一定程度上也可作為檢測(cè)多重耐藥結(jié)核分枝桿菌的一種手段[20-21]，為臨床醫(yī)生選擇治療方案提供診斷依據(jù)。本研究有一些局限性。本研究是一項(xiàng)單中心的回顧性分析，樣本量不足，部分信息缺失，并且未討論結(jié)核性腦膜炎、骨結(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核等肺外結(jié)核。有研究表明，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)對(duì)肺外結(jié)核有一定的診斷價(jià)值[22-23]，對(duì)于此類結(jié)核，選擇合適的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)十分重要。

綜上所述，Xpert MTB/RIF檢測(cè)具有高靈敏度、高特異度、易于操作、交叉污染少、可快速檢測(cè)利福平耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，能為肺結(jié)核的早期診斷及治療方案的選擇提供有效依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景，值得臨床推廣使用。