5味中藥醇提物對(duì)尼羅羅非魚(yú)白細(xì)胞免疫活性的作用

程 敏，李忠琴，翟少偉，賴曉健，楊求華，江興龍

( 1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021； 2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021； 3.廈門(mén)市漁用藥物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361021； 4.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門(mén) 361021 )

隨著科技的發(fā)展與生活質(zhì)量的提高，水產(chǎn)養(yǎng)殖持續(xù)發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大。環(huán)境污染和全球變暖等問(wèn)題的出現(xiàn)，使水產(chǎn)動(dòng)物病害的潛在風(fēng)險(xiǎn)受到廣大研究者的關(guān)注。許多中草藥都具有提高生物機(jī)體的非特異性免疫力的作用，如提高白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性，進(jìn)而能夠增強(qiáng)生物體抵抗病原侵害的能力，能夠有效的預(yù)防疾病的發(fā)生，而且中草藥屬于綠色天然植物，具有污染小、來(lái)源豐富、功能多樣等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)中草藥如連翹、黃芪、黃連等對(duì)于增強(qiáng)動(dòng)物體免疫能力亦具有突出作用[1-2]。中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控中具有廣泛應(yīng)用前景，如孟彬等[3]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)酵中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有明顯優(yōu)勢(shì)；中草藥添加劑提高了水產(chǎn)品的質(zhì)量，減少了化學(xué)藥物殘留[4-6]。因此，中草藥添加劑備受水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者的關(guān)注。筆者以尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)為研究對(duì)象，采用尼羅羅非魚(yú)離體外周血白細(xì)胞與中草藥提取液共孵育的方法，檢測(cè)共孵育后中草藥提取液對(duì)白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性的影響，考察多種中草藥對(duì)尼羅羅非魚(yú)免疫細(xì)胞激活效果，篩選出適合尼羅羅非魚(yú)養(yǎng)殖使用的天然免疫增強(qiáng)劑[7-11]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

尼羅羅非魚(yú)：試驗(yàn)魚(yú)均為養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖14 d以上的尼羅羅非魚(yú)。

中草藥：五倍子、白頭翁、地榆、柯子、虎杖。

儀器：酶標(biāo)儀(MULTISKAN GO、Thermo SCIENTIFIC)、流式細(xì)胞儀(CytoFLEX、貝克曼庫(kù)爾特)、超微粉碎機(jī)(SQW-601山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司)、生化培養(yǎng)箱(LRH-250、上海一恒科技學(xué)儀器有限公司)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 主要試驗(yàn)試劑及配制方法

Percoll細(xì)胞分離液、二甲基亞砜分析純、臺(tái)盼藍(lán)染液、L-15細(xì)胞培養(yǎng)液。

磷酸緩沖鹽溶液：用蒸餾水依次稀釋Na2HPO41.07 g，KH2PO40.398 g和NaCl 8.5 g，偶用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，然后用容量瓶定容至1000 mL，分裝后放置高壓滅菌鍋中，121 ℃下，高溫高壓滅菌20 min，滅菌結(jié)束后放置于冰箱中4 ℃保存。

抗凝劑：用已滅菌的磷酸緩沖鹽溶液將肝素鈉稀釋成3000 U/mL，用0.2 μm過(guò)濾器過(guò)濾后，置于4 ℃冰箱中保存。

0.2% NBT：將20 mg NBT加入10 mL已經(jīng)滅菌的磷酸緩沖鹽溶液中溶解，置于冰箱中4 ℃避光保存。

2 mol KOH:用已滅菌的去離子水稀釋11.2 g KOH固體，然后用容量瓶定容至100 mL，置于冰箱中4 ℃保存。

70%甲醇水溶液：用滅菌的去離子水稀釋，70 mL甲醇加入30 mL滅菌的去離子水中，置于冰箱中4 ℃保存。

5%二甲基亞砜溶液：用滅菌的磷酸緩沖鹽溶液配制,5 mL二甲基亞砜加入95 mL磷酸緩沖鹽溶液，置于冰箱4 ℃保存。

熒光微球懸液的制備：將標(biāo)準(zhǔn)微球懸液用滅菌的磷酸緩沖鹽溶液稀釋成密度為1×105個(gè)/mL的微球懸液。

70%乙醇溶液：用蒸餾水與95%的乙醇混合制備。

1.2.2 中草藥提取液的制備[12]

中藥的超微粉碎：將所選的中草藥用中藥粉碎機(jī)粉碎至約100目，將粉碎的藥粉放入超微粉碎機(jī)進(jìn)一步粉碎后，收集超微藥粉備用。

中草藥提取物樣品制備：將收集的超微藥粉過(guò)160目篩后，收集藥粉，按照料液比1∶10的比例將藥粉與60%的乙醇水溶液混合，用超聲波粉碎機(jī)超聲1 h，用濾紙過(guò)濾后收集濾液，將濾液置于多樣品平行蒸發(fā)儀中濃縮后制得中藥提取物，將中藥提取物置于4 ℃環(huán)境下保存。

稱取1.00 g的單味中草藥提取物，置于15 mL離心管，加10 mL 5%二甲基亞砜溶液后混勻。在恒溫振蕩儀中浸泡提取72 h，用離心機(jī)2500 r/min下離心10 min，用0.2 μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾上清液，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的藥液。依照此方法制備不同質(zhì)量濃度梯度試驗(yàn)藥液。

1.2.3 雙聯(lián)用藥液配制

依據(jù)5種中草藥提取液的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)[13]，分別將兩種中草藥的藥液等體積混合，藥液質(zhì)量濃度配比見(jiàn)表1，依照中草藥單用方法進(jìn)行操作。其中藥物組合(A+B)分別為：Ⅰ，五倍子+白頭翁；Ⅱ，五倍子+地榆；Ⅲ，五倍子+柯子；Ⅳ，五倍子+虎杖；Ⅴ，白頭翁+地榆；Ⅵ，白頭翁+柯子；Ⅶ，白頭翁+虎杖；Ⅷ，地榆+柯子；Ⅸ，地榆+虎杖；Ⅹ，柯子+虎杖。

表1 中草藥雙聯(lián)用質(zhì)量濃度配比Tab.1 Concentration proportion of Chinese herbal medicine for dual-prescription

1.2.4 尼羅羅非魚(yú)血漿的制備[14]

取經(jīng)14 d暫養(yǎng)的尼羅羅非魚(yú)，在1 L水體加入0.05 mL丁香酚進(jìn)行麻醉，用無(wú)菌注射器吸取0.2 mL抗凝劑，自魚(yú)尾靜脈采血0.5 mL,將魚(yú)血與L-15細(xì)胞培養(yǎng)基按體積比1∶9的比例混合，制成尼羅羅非魚(yú)血漿。

1.2.5 外周血白細(xì)胞的分離制備[15-16]

將無(wú)菌生理鹽水和Percoll細(xì)胞分離液按照不同的比例混合，制成70%、60%、50%、40%、30%的細(xì)胞分離混合液。每種比例的混合液設(shè)3個(gè)平行組，選擇最合適的Percoll細(xì)胞分離混合液分離制備尼羅羅非魚(yú)白細(xì)胞樣品。

1.2.6 尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞呼吸爆發(fā)試驗(yàn)[17]

取一塊96微孔板，將每一行設(shè)為一組，1～3孔為L(zhǎng)組，4～6孔為N組，第一行為空白對(duì)照組，其余各行為中草藥提取液試驗(yàn)組。(1)每孔加入白細(xì)胞懸液100 μL。(2)試驗(yàn)組每孔加入100 μL的中草藥提取液，空白對(duì)照組每孔加入100 μL的5%二甲基亞砜溶液，然后用磷酸緩沖鹽溶液將每孔補(bǔ)齊到300 μL。在室溫下孵育2 h，然后將每孔的上清液吸去100 μL，再用100 μL的L-15細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌3次。(3)向每行的1～3孔加入50 μL的L-15細(xì)胞培養(yǎng)基，每行的4～6孔各加入50 μL的L-15細(xì)胞培養(yǎng)液和0.2% NBT溶液，再用磷酸緩沖鹽溶液將每孔補(bǔ)齊到300 μL。置于室溫下孵育1 h，然后將每孔的上清液吸去100 μL，再加入100 μL的甲醇固定3 min，然后再去除100 μL的上清液，再用100 μL的70%甲醇溶液清洗3次。接著輕輕的吹去每孔的液體，在室溫下風(fēng)干后，在每孔中加入100 μL的2 mol KOH溶液和200 μL 100%二甲基亞砜，然后用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)630 nm下各孔的吸光值(OD)。

1.2.7 尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞吞噬試驗(yàn)[18-19]

試驗(yàn)組：將200 μL白細(xì)胞懸液分裝于已滅菌的1.5 mL離心管中，加入100 μL中草藥提取液，常溫下共孵育2 h，之后加入50 μL微球懸液，混勻后常溫下避光反應(yīng)，1 h后加入250 μL 70%甲醇固定，終止反應(yīng)，然后依次進(jìn)樣，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

對(duì)照組：將200 μL白細(xì)胞懸液分裝于已滅菌的1.5 mL離心管中，加入100 μL 5%二甲基亞砜，常溫下共孵育2 h，之后加入50 μL微球懸液，混勻后常溫下避光反應(yīng)，1 h后加入250 μL 70%甲醇固定，終止反應(yīng)，然后依次進(jìn)樣，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 白細(xì)胞呼吸爆發(fā)及吞噬率的計(jì)算公式

呼吸爆發(fā)活性=ODN-ODL

呼吸爆發(fā)增加率/%=(m1-m)/m×100%

細(xì)胞吞噬率/%=n1/n×100%

細(xì)胞吞噬增加率/%=(f1-f)/f×100%

呼吸爆發(fā)聯(lián)用指數(shù)=[(A2-A1)+(B2-B1)]/(A1+B1)

吞噬聯(lián)用指數(shù)=[(A4-A3)+(B4-B3)]/(A3+B3)

式中，ODN為N孔的吸光值，ODL為L(zhǎng)孔的吸光值；m1為試驗(yàn)組呼吸爆發(fā)活性，m為空白對(duì)照組呼吸爆發(fā)活性；n1為參與吞噬的細(xì)胞數(shù)，n為血細(xì)胞總數(shù)；f1為試驗(yàn)組細(xì)胞吞噬率，f為對(duì)照組細(xì)胞吞噬率；A1為A藥單用呼吸爆發(fā)增加率，A2為A藥聯(lián)用呼吸爆發(fā)增加率，B1為B藥單用呼吸爆發(fā)增加率，B2為B藥聯(lián)用呼吸爆發(fā)增加率；A3為A藥單用吞噬增加率，A4為A藥聯(lián)用吞噬增加率，B3為B藥單用吞噬增加率，B4為B藥聯(lián)用吞噬增加率。

2 結(jié)果與分析

2.1 外周血白細(xì)胞分離液的比例優(yōu)化

因?yàn)榘准?xì)胞分離試驗(yàn)是后續(xù)試驗(yàn)的鋪墊，要求其有較高的準(zhǔn)確性，所以對(duì)于這個(gè)部分的試驗(yàn)進(jìn)行了多次重復(fù)，以確定準(zhǔn)確性，對(duì)不同比例的Percoll細(xì)胞分離混合液的分離效果的研究表明，30%的Percoll細(xì)胞分離混合液分離的效果最好，獲得的白細(xì)胞密度最高，密度達(dá)107cfu/mL(表2)。

表2 外周血白細(xì)胞的分離液比例優(yōu)化Tab.2 Proportion optimization of leukocytes and percoll cell separation mixture

2.2 外周血白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性的測(cè)定

2.2.1 5味中草藥單用對(duì)白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性的影響

5味中草藥提取液與尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞共孵育的研究結(jié)果顯示，當(dāng)五倍子、白頭翁、地榆、柯子、虎杖的質(zhì)量濃度分別為0.5、50、1.5、1.5、2.0 mg/mL時(shí)，白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性值最高，其白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性增加率分別為128.68%、123.96%、28.37%、44.44%、78.93%。由試驗(yàn)結(jié)果可知，以上幾味中草藥提取液的白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性值均顯著高于其對(duì)照組，表明這5味中草藥均可顯著提高尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性。單用組間差異分析得出白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性在五倍子與柯子，虎杖與柯子具有顯著性；呼吸爆發(fā)活性增加率在五倍子與地榆、五倍子與柯子、五倍子與虎杖、白頭翁與地榆、白頭翁與柯子、白頭翁與虎杖具有顯著性(圖1、2)。

圖1 5味中草藥提取物單用的白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性Fig.1 Respiratory burst activity leukocytes of during treatement with five Chinese herbal extracts

圖2 5味中草藥提取物單用的白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性增加率Fig.2 Increase rate in respiratory burst activity in leukocytes during treatment with five Chinese herbal extracts不同字母表示具有顯著性差異，相同字母表示無(wú)顯著性差異，下同.Means with different letters are significant difference, and means with same letter are not significant difference, et sequentia.

2.2.2 5味中草藥雙聯(lián)用對(duì)白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性的影響

根據(jù)尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞呼吸爆發(fā)試驗(yàn)單用的結(jié)果，將上述中草藥提取液進(jìn)行雙聯(lián)用(最低抑菌質(zhì)量濃度)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)五倍子∶白頭翁的質(zhì)量濃度比例為2.0∶2.0、五倍子∶地榆的質(zhì)量濃度比例為0.5∶2.0、五倍子∶柯子的質(zhì)量濃度比例為0.5∶1.0、五倍子∶虎杖的質(zhì)量濃度比例為2.0∶0.5、白頭翁∶地榆的質(zhì)量濃度比例為2.0∶2.0、白頭翁∶柯子的質(zhì)量濃度比例為2.0∶2.0、白頭翁∶虎杖的質(zhì)量濃度比例為0.5∶1.0、地榆∶柯子的質(zhì)量濃度比例為2.0∶2.0、地榆∶虎杖的質(zhì)量濃度比例為1.0∶2.0、柯子∶虎杖的質(zhì)量濃度比例為0.5∶1.0時(shí)，白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性最高，其呼吸爆發(fā)活性增加率分別為138.93%、108.53%、58.70%、64.29%、106.55%、79.85%、115.17%、84.15%、63.76%、79.01%。呼吸雙聯(lián)用各組間顯著性分析得出，質(zhì)量濃度對(duì)白細(xì)胞免疫活性的作用的影響較小，不同中藥對(duì)白細(xì)胞免疫活性的作用的影響較大，差異顯著(表3、圖3)。

表3 中草藥提取物雙聯(lián)用的白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性增加率 %Tab.3 The increase rate in respiratory burst activity in leukocytes during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞呼吸爆發(fā)試驗(yàn)單用與雙聯(lián)用試驗(yàn)中白頭翁+地榆、白頭翁+柯子、白頭翁+虎杖、地榆+柯子、柯子+虎杖5組的聯(lián)用指數(shù)分別為1.28、0.10、0.51、0.54、0.02，其中，白頭翁+地榆表現(xiàn)出其顯著的協(xié)同作用(表4、圖4)。

2.3 外周血白細(xì)胞吞噬活性的分析

2.3.1 5味中草藥單用對(duì)白細(xì)胞吞噬活性的影響

對(duì)上述篩選的單獨(dú)使用可顯著提高尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性的5味中草藥，進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)外周血白細(xì)胞吞噬活性的影響，再采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)白細(xì)胞吞噬率。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)五倍子、白頭翁、地榆、柯子、虎杖的質(zhì)量濃度分別為0.125、25.0、1.5、1.5、0.5 mg/mL、時(shí)，均能顯著提高尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞的吞噬活性(圖5)，吞噬率較對(duì)照組分別增加了44.04%、44.66%、95.00%、10.35%、64.93%，之后隨地榆、柯子、五倍子、虎杖4種中草藥的質(zhì)量濃度增加，吞噬率下降，甚至出現(xiàn)抑制；而當(dāng)白頭翁質(zhì)量濃度增加時(shí)，吞噬率趨于平穩(wěn)。而組間的吞噬效果沒(méi)有明顯差異。

圖3 雙聯(lián)用呼吸爆發(fā)活性增加率及顯著性分析Fig.3 The increase rate and significance of respiratory burst activity in leukocytes during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

表45味中草藥雙聯(lián)用的呼吸爆發(fā)聯(lián)用指數(shù)

Tab.4 Combination index of respiratory burst index during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

圖4 5味中草藥單用和雙聯(lián)用呼吸爆發(fā)增加率對(duì)比Fig.4 Comparison of increase rate in respiratory burst activity in leukocytes between treatment with single and dual-prescription of five Chinese herbal extracts

2.3.2 5味中草藥雙聯(lián)用對(duì)白細(xì)胞吞噬活性的影響

依照尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞吞噬活性試驗(yàn)單用的結(jié)果，將上述中草藥提取液進(jìn)行雙聯(lián)用，試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)五倍子∶白頭翁的質(zhì)量濃度比例為0.5∶1.0、五倍子∶地榆的質(zhì)量濃度比例為0.5∶1.0、五倍子∶柯子的質(zhì)量濃度比例為0.5∶1.0、五倍子∶虎杖的質(zhì)量濃度比例為0.5∶0.5、白頭翁∶地榆的質(zhì)量濃度比例為2.0∶1.0、白頭翁∶柯子的質(zhì)量濃度比例為2.0∶1.0、白頭翁∶虎杖的質(zhì)量濃度比例為2.0∶1.0、地榆∶柯子的質(zhì)量濃度比例為1.0∶1.0、地榆∶虎杖的質(zhì)量濃度比例為0.5∶0.5、柯子∶虎杖的質(zhì)量濃度比例為1.0∶0.5時(shí)，吞噬增加率最高，分別為45.96%、58.53%、38.83%、23.84%、59.48%、62.85%、92.27%、59.70%、86.27%、69.22%。吞噬雙聯(lián)用各組間顯著性分析得出，質(zhì)量濃度對(duì)白細(xì)胞吞噬增加率的作用的影響較小，不同中藥對(duì)白細(xì)胞吞噬增加率作用的影響較大，差異顯著(表5、圖6)。

圖5 白細(xì)胞與中藥共孵育后吞噬活性增加率Fig.5 Increase rate in phagocytic activity in leukocytes treated with five Chinese herbal extracts

尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞吞噬活性單用與雙聯(lián)用試驗(yàn)中，五倍子+白頭翁、五倍子+柯子、五倍子+虎杖、白頭翁+柯子、白頭翁+虎杖、地榆+柯子、地榆+虎杖、柯子+虎杖8組的細(xì)胞吞噬聯(lián)用指數(shù)分別是0.90、0.78、3.03、1.06、11.45、0.13、0.28、6.20，其中五倍子+虎杖、白頭翁+柯子、白頭翁+虎杖、柯子+虎杖表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用(表6、圖7)。

表5 5味中草藥雙聯(lián)用的白細(xì)胞吞噬力增加率 %Tab.5 Increase rate in phagocytosis in leukocytes treated with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

圖6 5味中草藥雙聯(lián)用的白細(xì)胞吞噬力比較Fig.6 Comparison of phagocytosis in leukocytes treated with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

表6 五味中草藥雙聯(lián)用的吞噬聯(lián)用指數(shù)Tab.6 Combination of phagocytosis index during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

3 討 論

3.1 細(xì)胞分離液對(duì)外周血白細(xì)胞分離效果的影響

不同品種的魚(yú)類，其血細(xì)胞的構(gòu)成和血液指數(shù)也會(huì)不同，因此，對(duì)于不同品種的魚(yú)，Percoll細(xì)胞分離混合液分離的條件也會(huì)不同。已有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)

圖7 5味中草藥單用和雙聯(lián)用吞噬增加率對(duì)比Fig.7 Comparison of the increase rate of phagocytic activity in leukocytes treated with single and dual-prescription of five Chinese herbal extracts

分離液的密度為1.080～1.085時(shí)，可將草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)和鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)外周血白細(xì)胞有效的分離出來(lái)[20]，本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，30%的Percoll細(xì)胞分離混合液的分離效果最好，與草魚(yú)和鯉魚(yú)的細(xì)胞分離液密度較為接近[21]。

3.2 白細(xì)胞吞噬活性測(cè)定方法的建立

經(jīng)過(guò)對(duì)比幾種測(cè)定白細(xì)胞吞噬的方法發(fā)現(xiàn)，流式細(xì)胞儀技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的技術(shù)而言，具有顯著的優(yōu)勢(shì)，如測(cè)定的準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好且操作簡(jiǎn)單。顯微鏡鏡檢法通過(guò)對(duì)細(xì)胞的染色，可直接用肉眼在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征及細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。通過(guò)這種方法也確實(shí)獲得了許多關(guān)于細(xì)胞形態(tài)及功能的信息，但是鏡檢法也存在許多缺點(diǎn)，如重復(fù)性差和主觀性強(qiáng)等問(wèn)題。而相比較而言，流式細(xì)胞儀技術(shù)就能很好地解決這種主觀性問(wèn)題,不僅測(cè)定準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好且操作簡(jiǎn)單快捷，因此本試驗(yàn)最終以流式細(xì)胞儀技術(shù)為檢測(cè)方法[22]。

3.3 中草藥增強(qiáng)白細(xì)胞免疫活性的分析

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖的持續(xù)發(fā)展，人們已經(jīng)將水產(chǎn)病害防治研究的目光轉(zhuǎn)向了中草藥這種即安全又高效的藥物。本研究以尼羅羅非魚(yú)為對(duì)象，結(jié)合5味中草藥的提取液，再利用氮藍(lán)四唑還原法和流式細(xì)胞儀技術(shù)分別檢測(cè)這5味中草藥提取液對(duì)尼羅羅非魚(yú)血清免疫細(xì)胞的影響，初步篩選出能夠提高尼羅羅非魚(yú)非特異性免疫能力的中草藥免疫增強(qiáng)劑。通過(guò)對(duì)以上5種中草藥兩兩聯(lián)用后，在氧呼吸爆發(fā)雙聯(lián)用試驗(yàn)中，表現(xiàn)出協(xié)同作用的有白頭翁+地榆、地榆+柯子、白頭翁+虎杖，在吞噬雙聯(lián)用試驗(yàn)中，表現(xiàn)出協(xié)同作用的有五倍子+白頭翁、白頭翁+虎杖、柯子+虎杖。

相比較本試驗(yàn)的方法而言，以往的研究主要是采用拌料投喂的方式進(jìn)行，這種方式不僅耗時(shí)久，而且不適合快速篩選大量的樣品[23]。而本試驗(yàn)采用離體外周血白細(xì)胞與中草藥提取液共孵育的方法，快速檢測(cè)這5味中草藥對(duì)尼羅羅非魚(yú)血清免疫細(xì)胞的影響，這種方法具有篩選成本低，篩選速度快等優(yōu)點(diǎn)，而且很適合對(duì)大量的樣品進(jìn)行快速篩選[24]。

4 結(jié) 論

通過(guò)建立離體尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞與中草藥提取液共孵育的方法，再結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性的影響進(jìn)行檢測(cè)，單用試驗(yàn)結(jié)果顯示，五倍子、白頭翁、地榆、柯子和虎杖5味中草藥均能顯著增強(qiáng)尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性。呼吸爆發(fā)活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在最適的質(zhì)量濃度下，5味中草藥提取液的白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性值均顯著高于其對(duì)照組，均可以顯著提高尼羅羅非魚(yú)外周血白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性，其呼吸爆發(fā)活性增加率為五倍子>白頭翁>虎杖>柯子>地榆。吞噬活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在最適質(zhì)量濃度下，5味中草藥吞噬率均優(yōu)于對(duì)照組，其提高吞噬率效果為地榆>虎杖>白頭翁>五倍子>柯子。

5味中草藥雙聯(lián)用的研究結(jié)果表明，在呼吸爆發(fā)活性雙聯(lián)用試驗(yàn)組合中表現(xiàn)明顯協(xié)同作用，且活性為白頭翁+地榆>白頭翁+虎杖；在吞噬活性雙聯(lián)用試驗(yàn)組合中表現(xiàn)明顯協(xié)同作用，且活性為白頭翁+虎杖>柯子+虎杖>五倍子+虎杖>白頭翁+柯子。

綜合呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性的試驗(yàn)結(jié)果，可白頭翁+虎杖選擇組合開(kāi)發(fā)成漁藥，能顯著提高養(yǎng)殖尼羅羅非魚(yú)血漿白細(xì)胞免疫活性，進(jìn)而提高其抗病力。本研究可為此5味中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖防病上的應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)。