固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定燕窩中揮發(fā)性成分

柳訓(xùn)才，張小江，張曉婷，徐敦明，范群艷*

( 1.燕之屋絲濃食品有限公司燕窩技術(shù)中心，福建 廈門 361100；2.廈門海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 廈門 361026)

燕窩為雨燕科金絲燕舌下腺分泌的唾液凝結(jié)于懸崖、洞內(nèi)峭壁上或樓屋內(nèi)的橫梁上筑成的巢窩，主產(chǎn)于印度尼西亞、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、越南等地[1-4]。其性平，味甘，有補(bǔ)肺養(yǎng)陰的作用，自古以來(lái)被視為一種食補(bǔ)極品、名貴藥材。其中表皮生長(zhǎng)因子、唾液酸、人體必需氨基酸、礦質(zhì)元素、維生素B1、?；撬帷⑻堑鞍椎瘸煞值陌l(fā)現(xiàn)很好地詮釋了燕窩諸多的生物功效，如促進(jìn)表皮生長(zhǎng)、滋陰養(yǎng)肺、化痰止咳、抗氧化、抗病毒、延緩衰老、保護(hù)軟骨組織等[5-7]。

未經(jīng)燉煮的燕窩具有一種類似生蛋清的特殊氣味，研究構(gòu)成這種特殊性氣味的揮發(fā)性成分組成及含量變化對(duì)了解燕窩的氣味特征，探索燕窩品種/產(chǎn)地的鑒定、燕窩質(zhì)量的控制均具有十分重要的意義。但由于燕窩中揮發(fā)性成分含量低、易揮發(fā)、難萃取和濃縮，因此，有必要建立一種快速簡(jiǎn)便的燕窩揮發(fā)性成分提取和檢測(cè)新技術(shù)。目前對(duì)于食品中揮發(fā)性成分的分析通常采用感官分析[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[10-12]、氣相色譜-嗅聞(Gas chromatography olfactometry,GC-O)[13-14]和電子鼻(Electronic nose,Enose)[15-17]等。其中，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用更能有效地對(duì)成分進(jìn)行定性與定量分析。而固相微萃取(SPME)技術(shù)是一種集萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的樣品前處理新方法，具有快速簡(jiǎn)單、費(fèi)用少、易于自動(dòng)化、不需要溶劑等優(yōu)點(diǎn)[18]，已廣泛應(yīng)用于藥用[19]和香料植物[20]、茶葉[21]、肉類[22]和農(nóng)藥殘留量[23]檢測(cè)的樣品前處理，但尚未利用此項(xiàng)技術(shù)在燕窩中進(jìn)行氣味研究。鑒于此，本文采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)探索燕窩中揮發(fā)性成分的參數(shù)條件，以期為燕窩的鑒定和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 供試材料

產(chǎn)地為印尼的燕盞，由廈門燕之屋絲濃食品有限公司提供。

1.2 儀器

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(島津公司，GCMS-TQ8040)，配石英毛細(xì)管色譜柱(Agilent公司，DB-5MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm)；SPME手動(dòng)進(jìn)樣器及65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)萃取頭(Supelco公司，57330-U和57320-U)；水浴鍋(群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，BHS-2)。

儀器參數(shù)：進(jìn)樣口：溫度250 ℃，進(jìn)樣時(shí)間2 min，不分流進(jìn)樣，2 min開(kāi)啟隔墊吹掃；程序升溫：初始溫度40 ℃，保留2 min,以10 ℃/min的速率升至260 ℃，保留6 min；載氣：He，流速：1.0 mL/min；接口溫度：260 ℃；電子轟擊離子源(EI)：230 ℃，電離能量：70 eV；質(zhì)譜模式：正離子，Q3 SCAN，離子掃描范圍(m/z)：45～400。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將燕盞粉碎成1 mm左右的顆粒，稱取6 g樣品于20 mL頂空瓶中，密封后將頂空瓶置于60 ℃水浴鍋中平衡20 min。再插入經(jīng)過(guò)熱清洗的65 μm PDMS/DVB萃取頭進(jìn)行頂空萃取，繼續(xù)保溫60 min。保溫結(jié)束后立即將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取頭的選擇

在相同的萃取及測(cè)定條件下，比較了100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(Carboxen/PDMS)、85 μm聚丙烯酸酯(Polyacrylate)4種萃取頭對(duì)揮發(fā)性成分的萃取效果，扣除掉樣品空白的背景峰后，4種萃取頭分別進(jìn)樣測(cè)定總離子流圖(TIC)的峰數(shù)和總峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4種萃取頭對(duì)燕窩中揮發(fā)性成分的吸附效果

根據(jù)SPME產(chǎn)品手冊(cè)說(shuō)明，PDMS通常用于非極性揮發(fā)性化合物(MW 60～275)，Carboxen/PDMS用于氣體和低分子量化合物(MW 30～225)，Polyacrylate用于極性半揮發(fā)性化合物(MW 80～300)，而PDMS/DVB用于揮發(fā)性物質(zhì)、胺類、硝基芳香類化合物(MW 50～300)，其適用范圍更廣。表1的數(shù)據(jù)也證實(shí)了此結(jié)論，無(wú)論從峰數(shù)還是總峰面積，65 μm PDMS/DVB的萃取效果均強(qiáng)于其它3種萃取頭，另外3種萃取頭中，PDMS和Polyacrylate的總離子流圖的峰數(shù)相近，且優(yōu)于Carboxen/PDMS。此外，盡管萃取頭固定相的膜厚對(duì)萃取效果有重要影響，且較厚的膜更容易萃取高沸點(diǎn)化合物，但從表1可知，SPME固定相的極性比膜厚對(duì)萃取效率的影響更大。因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇65 μm的PDMS/DVB萃取頭對(duì)燕窩中的揮發(fā)性成分進(jìn)行萃取。

圖1 萃取溫度對(duì)SPME萃取燕窩中揮發(fā)性成分的影響

2.2 萃取溫度的影響

為考察溫度對(duì)PDMS/DVB萃取效果的影響，實(shí)驗(yàn)比較了萃取時(shí)間為30 min，溫度分別為40、50、60、70、80、90、100 ℃時(shí)，進(jìn)樣測(cè)定總離子流圖(TIC)的出峰數(shù)和總峰面積(見(jiàn)圖1)。由圖1可見(jiàn)，隨著萃取溫度不斷的升高，可檢出萃取物的總峰數(shù)和總峰面積不斷增大。從圖2可觀察到，萃取溫度越高，絕大部分檢出物的含量均有提高，且保留時(shí)間大于15 min時(shí)含量提高程度更顯著。二圖均顯示，隨著萃取溫度的升高，燕窩中一些分子量大且較難揮發(fā)的物質(zhì)逐步從燕窩中釋放出來(lái)，且在100 ℃時(shí)仍呈上升趨勢(shì)?？紤]到后續(xù)將對(duì)SPME的測(cè)定數(shù)據(jù)與室溫下的感官嗅覺(jué)進(jìn)行比較，本研究最終選擇60 ℃作為萃取溫度。

圖2 萃取溫度為60 ℃(黑)與80 ℃(紅)時(shí)燕窩中揮發(fā)性成分的TIC圖

圖3 萃取時(shí)間對(duì)SPME萃取燕窩中揮發(fā)性成分的影響

2.3 萃取時(shí)間的影響

為考察萃取時(shí)間對(duì)PDMS/DVB萃取效果的影響，實(shí)驗(yàn)比較了60 ℃下萃取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、80、100、120、150 min時(shí)的測(cè)定結(jié)果(見(jiàn)圖3)。結(jié)果顯示，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，萃取頭萃取的揮發(fā)性成分的總峰面積不斷升高，在60 min后變得平緩，120 min時(shí)接近平穩(wěn)，表明65 μm的PDMS/DVB萃取頭在120 min時(shí)達(dá)到吸附-解吸的平衡；進(jìn)一步比較萃取時(shí)間為60 min和120 min時(shí)燕窩中揮發(fā)性成分的TIC圖(圖4)，發(fā)現(xiàn)隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，總峰面積的增加來(lái)自于保留時(shí)間較長(zhǎng)(沸點(diǎn)較高)的峰的貢獻(xiàn)。如保留時(shí)間為11.13 min的正壬醇，在60 min后已基本趨于飽和，而對(duì)于保留時(shí)間為17.85 min的1-十四碳醇，在120 min后峰面積仍有很大變動(dòng)，相對(duì)于60 min處，其峰面積增加了約1/3。而峰數(shù)隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)變化不大，在151～176 之間波動(dòng)(平均值為164 個(gè))，峰數(shù)的波動(dòng)可能是由低含量的高沸點(diǎn)成分的色譜峰高在識(shí)別限值附近輕微波動(dòng)，被積分參數(shù)中設(shè)置的閾值過(guò)濾掉所導(dǎo)致。鑒于萃取效率在60 min后逐漸趨于平緩，且所萃取的成分已具有一定代表性，因此選擇60 min作為本實(shí)驗(yàn)的萃取溫度。

2.4 解吸時(shí)間的影響

比較了解吸時(shí)間分別為0.5、2、3、4、5 min時(shí)，TIC圖的總峰面積及峰數(shù)目。結(jié)果表明，不同解吸時(shí)間下，TIC圖中的峰面積在1.70×108～1.68×108，峰數(shù)在143～150 個(gè)之間波動(dòng)，2 min即能夠?qū)PME中萃取的物質(zhì)完全解吸出來(lái)；繼續(xù)延長(zhǎng)解吸時(shí)間,解吸效果差別不大。因此實(shí)驗(yàn)選擇2 min作為最佳解吸時(shí)間(GC-MS進(jìn)樣時(shí)間)

圖4 萃取時(shí)間為60 min(黑)與120 min(紅)時(shí)燕窩中揮發(fā)性成分的TIC圖

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

為考察該測(cè)定方法的重復(fù)性，按照“1.3”進(jìn)行燕窩樣品的處理和測(cè)定，連續(xù)平行測(cè)定6次，分別計(jì)算TIC圖中的峰數(shù)和總峰面積。結(jié)果顯示，連續(xù)平行測(cè)定6次，TIC圖中峰數(shù)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.99%，總峰面積的RSD為0.62%。方法具有較好的重復(fù)性，可用于燕窩中揮發(fā)性成分的測(cè)定。但需指出的是，因SPME萃取頭的使用壽命較短(本實(shí)驗(yàn)所用SPME萃取頭的使用參數(shù)為50～100 次)，在考慮方法的再現(xiàn)性時(shí)需對(duì)SPME的性能狀態(tài)予以重視。

2.6 成分分析

按照“1.3”進(jìn)行燕窩樣品的處理，測(cè)定其揮發(fā)性成分(見(jiàn)圖5)，同時(shí)做樣品空白。將測(cè)定結(jié)果扣除樣品空白后，對(duì)色譜峰逐一以NIST 14與NIST 14s質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索分析，并以峰面積歸一法確定組分中揮發(fā)性成分的相對(duì)含量(見(jiàn)表2)。結(jié)果顯示，燕窩氣味構(gòu)成復(fù)雜，其中以烴類(43種)、醇類(16種)、醛類(17種)、醚類(4種)、酯類(4種)為主，含量占比分別為39.29%、21.94%、17.77%、7.23%、4.06%，其余為酮類、酸類、酚類、噻唑類、吡喃類，共計(jì)82種，共同組成了燕窩的特殊氣味。

圖5 SPME/GC-MS測(cè)定時(shí)燕窩中揮發(fā)性成分的TIC圖

表2 燕窩中揮發(fā)性成分以NIST 14和NIST 14s進(jìn)行檢索的結(jié)果

(續(xù)表2)

No.Retention time(min)CASComponentContent(%)Similarity(%)5515.8752425-77-61-Decanol,2-hexyl-(2-己基-1-癸醇)0.49895616.07013475-75-7Pentadecane,8-hexyl-(8-己基十五烷)0.62865716.28827538-41-611-Methyltricosane(11-甲基二十三烷)0.96885816.3644337-65-9Hexanedioic acid,mono(2-ethylhexyl)ester(己二酸1-(2-乙基己基)酯)2.24835916.525112-95-8Eicosane(正二十烷)1.13926016.6092882-96-4Pentadecane,3-methyl-(3-甲基十五烷)1.86936116.961629-94-7Heneicosane(正二十一烷)2.46966217.20325117-26-4Hexadecane,4-methyl-(4-甲基十六烷)0.10836317.3551560-89-0Heptadecane,2-methyl-(2-甲基十七烷)0.09806417.415119-61-9Benzophenone(二苯甲酮)0.46966517.5063892-00-0Pentadecane,2,6,10-trimethyl-(2,6,10-三甲基十五烷)1.23926617.54624851-98-7Cyclopentaneacetic acid,3-oxo-2-pentyl-,methyl ester(二氫茉莉酮酸甲酯)0.28826717.6631795-21-7Cyclopentane,decyl-(1-環(huán)戊基癸烷)0.93886817.6981561-02-02-Methylhexacosane(2-甲基二十六烷)0.45836917.851112-72-11-Tetradecanol(1-十四碳醇)0.76807017.9293075-84-11,1′-Biphenyl,2,2′,5,5′-tetramethyl-(2,2′,5,5′-四甲基聯(lián)苯)0.56837118.121629-78-7Heptadecane(正十七烷)1.03937218.1551921-70-6Pentadecane,2,6,10,14-tetramethyl-(2,6,10,14-四甲基-十五烷)0.73807318.29326627-85-0Hexacosanal(正二十六碳醛)0.32857418.75126429-11-8Heptadecane,4-methyl-(4-甲基十七烷)0.21837518.9066418-44-6Heptadecane,3-methyl-(3-甲基十七烷)0.33937619.447110-27-0Isopropyl myristate(十四酸異丙酯)0.03807719.6231120-36-11-Tetradecene(1-十四烯)0.14887819.7821222-05-5Cyclopenta[g]-2-benzopyran,1,3,4,6,7,8-hexahydro-4,6,6,7,8,8-hexamethyl-(佳樂(lè)麝香)0.05817920.05736653-82-41-Hexadecanol(1-十六碳醇)0.83978020.6725333-42-61-Dodecanol,2-octyl-(辛基十二烷醇)0.09908121.67018435-45-51-Nonadecene(1-十九碳烯)0.06908222.0682004-39-91-Heptacosanol(1-二十七碳醇)0.0794

3 結(jié) 論

本文建立了SPME/GC-MS 檢測(cè)燕窩中揮發(fā)性成分的分析方法，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以65 μm PDMS/DVB萃取頭在60 ℃下吸附60 min，解吸2 min后，采用GC-MS對(duì)燕窩樣品進(jìn)行測(cè)定并輔以NIST 14和NIST 14s檢索，可獲得較好的分析結(jié)果，檢出醇、烴、醛、酯、醚類等化合物共82種。該方法具有吸附效果好，檢測(cè)靈敏度高，無(wú)需溶劑，直接進(jìn)樣，且操作簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)，因而是一種很有應(yīng)用前景的技術(shù)，有望廣泛用于燕窩揮發(fā)性成分的測(cè)定。