黃芪多糖通過(guò)AMPK/SIRT1/PGC-1α途徑對(duì)糖尿病腎病腎小管上皮細(xì)胞線粒體的影響

徐雪垠

南通市第一人民醫(yī)院，江蘇南通226000

糖尿病可以誘發(fā)多種并發(fā)癥，其中糖尿病腎病(DN)發(fā)病率較高，約有1/3糖尿病患者會(huì)合并DN。此外，DN也已成為引起終末期腎病的主要病因之一。目前，對(duì)于DN的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論。研究表明，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)可以通過(guò)沉默調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)/過(guò)氧化酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)途徑調(diào)節(jié)線粒體代謝，改善腎臟細(xì)胞狀態(tài)及活性，減緩DN發(fā)生及發(fā)展。黃芪多糖(APS)是中藥黃芪的主要成分，研究表明，其可以通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)分化，修復(fù)足細(xì)胞進(jìn)而延緩DN發(fā)展[1, 2]。但是APS對(duì)于DN腎小管上皮細(xì)胞中線粒體的作用和機(jī)制尚不明確。2018年1月～2019年10月，本研究檢測(cè)了APS對(duì)DN腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能、細(xì)胞凋亡及對(duì)SIRT1途徑的影響，為治療DN提供新的治療靶點(diǎn)以及理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)購(gòu)于國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)。黃芪多糖(>68%)(大連美侖生物)；抗GAPDH一抗、抗SIRT1一抗、抗PGC-1α一抗、抗AMPK一抗以及抗p-AMPK一抗(Cell Signaling Technology)；小鼠及兔二抗(ProteinTech)、選擇性SIRT1抑制劑Ex 527、ATP含量測(cè)定試劑盒、CCK-8試劑盒以及LDH測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；ECL發(fā)光液(Bio-Rad)；Caspase-9活性測(cè)定試劑盒(BioVision)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HK-2細(xì)胞采用低糖RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10%胎牛血清)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，每2天換液一次。細(xì)胞生長(zhǎng)融合到80%左右時(shí)，用適量0.25%胰酶進(jìn)行消化，當(dāng)顯微鏡下觀察到細(xì)胞縮至圓形，加入適量含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，并反復(fù)輕輕吹打，使貼壁細(xì)胞重懸，細(xì)胞懸液按照相應(yīng)比例稀釋之后繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組及干預(yù)方法 將細(xì)胞分為對(duì)照組、高糖組、APS組、Ex 527組。處理12 h，所有組別更換為無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，高糖組在1640培養(yǎng)基中加入30 mmol/L葡萄糖(終濃度)；APS組在RPMI1640培養(yǎng)基中加入30 mmol/L葡萄糖和200 mg/L APS(終濃度)；Ex 527組在RPMI1640培養(yǎng)基中加入30 mmol/L葡萄糖、200 mg/L APS以及10 μmol/L Ex 527(終濃度)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞活性 采用CCK8法測(cè)定。將HK-2細(xì)胞接種于96孔板中，密度為2×104/孔。5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基為不含胎牛血清的低糖RPMI1640培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，按照不同實(shí)驗(yàn)要求用藥物進(jìn)行刺激。刺激結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK8溶液；孵育1 h后，測(cè)定450 nm處吸光度。細(xì)胞活性(%)=(處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)×100%。

1.4.2 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率 將HK-2細(xì)胞接種于96孔板中，密度為2×104/孔。5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基為不含胎牛血清低糖RPMI1640培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，按照不同實(shí)驗(yàn)要求用藥物進(jìn)行刺激。刺激結(jié)束后，收集細(xì)胞上清120 μL到新的96孔板中，加入60 μL LDH檢測(cè)工作液，混勻，室溫避光孵育30 min；檢測(cè)490 nm處吸光度。LDH漏出率(%)=(處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)×100%。以LDH漏出率反映細(xì)胞毒性。

1.4.3 ATP含量 HK-2細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%左右時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，并按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，給予不同藥物刺激。裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min，取上清待用。參照說(shuō)明書，配制ATP檢測(cè)工作液，將100 μL ATP檢測(cè)工作液加入檢測(cè)孔中，室溫放置3～5 min以消除本底。在檢測(cè)孔內(nèi)加入100 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速用移液器混勻，檢測(cè)化學(xué)發(fā)光值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中ATP濃度。

1.4.4 SIRT1 mRNA表達(dá) 采用real-time PCR法進(jìn)行測(cè)定。HK-2細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%左右時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，并按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，給予不同藥物刺激。按照說(shuō)明書，提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的相關(guān)說(shuō)明，合成cDNA。分別以1 μL cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變型3 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；溶解曲線為：95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min；由60 ℃到95 ℃，每10 s升高0.5 ℃，共需81個(gè)循環(huán)；記錄各樣品基因的循環(huán)域值(Ct值)。β-actin上游引物5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3′，下游引物5′-GATGTCCACGTCACACTTCA-3′；SIRT1上游引物5′-GATTGGCACAGATCCTCGAA-3′，下游引物5′-GTCTACAGCAAGGCGAGCATA-3′。根據(jù)內(nèi)參計(jì)算相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.5 SIRT1、AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。根據(jù)BCA法蛋白定量結(jié)果，調(diào)整蛋白濃度為30 μg/mL。加入適量5×上樣緩沖液，混勻，95 ℃加熱10 min，立即放在冰上冷卻。根據(jù)所分離蛋白大小配制濃度分離膠，將之前變性的樣品，根據(jù)所選用體系的承載量和實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行上樣。電泳分離后，將蛋白質(zhì)條帶從膠上轉(zhuǎn)移到膜上，采用5%脫脂奶粉對(duì)膜上潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。SIRT1、AMPK、p-AMPK、PGC-1α以及GAPDH一抗孵育過(guò)夜，根據(jù)不同一抗選擇相應(yīng)二抗孵育1 h后，使用ECL發(fā)光液曝光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Image J軟件分析相應(yīng)條帶灰度，并根據(jù)內(nèi)參計(jì)算相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6 Caspase-9活性檢測(cè) 采用熒光法。HK-2細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%左右時(shí)，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，并按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，給予不同藥物刺激；刺激結(jié)束后，加入適量裂解液，冰上裂解10 min；參照說(shuō)明書，細(xì)胞裂解液加入等體積2×Reaction Buffer，以及1/10體積LEHD-AFC，37 ℃孵育1～2 h；測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)400 nm，吸收波長(zhǎng)505 nm。Caspase-9活性變化量=實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活性比較 高糖組細(xì)胞活性低于對(duì)照組，APS組細(xì)胞活性高于高糖組(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

圖1 各組細(xì)胞活性比較

2.2 各組LDH漏出率比較 高糖組LDH漏出率高于對(duì)照組，APS組LDH漏出率低于高糖組(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

圖2 各組LDH漏出率比較

2.3 各組ATP生成量比較 高糖組ATP生成量低于對(duì)照組，APS組ATP生成量高于高糖組(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

圖3 各組ATP生成量比較

2.4 各組Caspase-9活性比較 高糖組Caspase-9活性高于對(duì)照組，APS組Caspase-9活性低于高糖組(P均<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

圖4 各組Caspase-9活性比較

2.5 各組SIRT1 mRNA表達(dá)量比較 高糖組SIRT1 mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組，APS組SIRT1 mRNA表達(dá)量高于高糖組(P均<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

圖5 各組SIRT1 mRNA表達(dá)量比較

2.6 各組SIRT1、AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)量比較 各組間AMPK表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高糖組p-AMPK表達(dá)量低于對(duì)照組，APS組p-AMPK表達(dá)量高于高糖組(P均<0.05)，見(jiàn)圖6。高糖組SIRT1和PGC-1α表達(dá)量均低于對(duì)照組，APS組SIRT1和PGC-1α表達(dá)量均高于高糖組(P均<0.05)，見(jiàn)圖7。

2.7 SIRT1抑制劑Ex527對(duì)APS作用的影響 高

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

圖6 各組AMPK蛋白表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05。

圖7 各組SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)量比較

糖組細(xì)胞活性低于對(duì)照組，APS組細(xì)胞活性高于高糖組，Ex527組細(xì)胞活性低于APS組(P均<0.05)，見(jiàn)圖8。高糖組LDH漏出率高于對(duì)照組，APS組LDH漏出率高于高糖組，Ex527組LDH漏出率高于APS組(P均<0.05)，見(jiàn)圖9。

3 討論

作為糖尿病最主要的并發(fā)癥之一，DN嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量，緩解DN的發(fā)生發(fā)展，對(duì)于糖尿病患者意義重大。目前，關(guān)于DN發(fā)生發(fā)展的機(jī)制有多種不同學(xué)說(shuō)，其中“統(tǒng)一機(jī)制”學(xué)說(shuō)得到了廣泛的認(rèn)可。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為高血糖所引發(fā)的活性氧增多，是糖尿病患者發(fā)生微小血管病變的主要誘因之一[3, 4]。由于活性氧主要在線粒體產(chǎn)生，因此越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注線粒體在DN中發(fā)揮的重要作用[5, 6]。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05；與APS組比較，△P<0.05。

圖8 SIRT1抑制劑Ex527對(duì)細(xì)胞活性的影響

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05；與APS組比較，△P<0.05。

圖9 SIRT1抑制劑Ex527對(duì)LDH漏出率的影響

APS是中藥黃芪的主要有效活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)于改善老年糖尿病小鼠糖脂代謝、維持DN大鼠足細(xì)胞Nephrin和Podocin表達(dá)[7]、抑制DN中腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[8]等有著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，高糖誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞活性明顯降低，同時(shí)細(xì)胞上清中LDH漏出率明顯提高；APS組細(xì)胞活性高于高糖組，而LDH漏出率低于高塘組，表明APS對(duì)高糖誘導(dǎo)后的HK-2細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。但其中的作用尚不明確，需要進(jìn)一步地研究。

腎臟兼具分泌和重吸收等多項(xiàng)功能，是一個(gè)高耗能器官，耗氧量?jī)H次于心臟。因此，作為細(xì)胞內(nèi)主要的供能細(xì)胞器，線粒體在維持腎臟功能穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的作用；通常使用ATP生成量表示線粒體的功能完整性[9]。此外，當(dāng)線粒體功能受損時(shí)，可通過(guò)激活Caspase-9啟動(dòng)線粒體途徑凋亡。Caspase家族蛋白在凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，細(xì)胞凋亡過(guò)程也是Caspase的級(jí)聯(lián)放大過(guò)程；其中Caspase9參與線粒體通路，是線粒體凋亡發(fā)生的主要標(biāo)志之一[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)后，HK-2細(xì)胞中ATP生成量顯著降低、Caspase9活性增加，而APS可以上調(diào)ATP含量、抑制Caspase-9過(guò)度激活，推測(cè)APS對(duì)高糖誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能通過(guò)維持線粒體功能、抑制線粒體途徑凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)。

AMPK/SIRT1/PGC-1α是調(diào)控線粒體的主要途徑之一[11]。AMPK被稱為是能量代謝感受器，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值升高時(shí)，AMPK被激活，p-AMPK水平顯著升高，并進(jìn)一步上調(diào)SIRT1表達(dá)[12, 13]。SIRT1隸屬于Sirtuin家族，是一種重要的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性去乙酰化酶，在能量代謝、衰老等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。SIRT1通過(guò)去乙?；饔锰岣逷GC-1α表達(dá)，后者作為線粒體生物合成的重要調(diào)控因子，可直接調(diào)控線粒體數(shù)量及功能[14, 15]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)后，HK-2細(xì)胞中AMPK表達(dá)沒(méi)有明顯變化，但p-AMPK表達(dá)顯著下調(diào)；APS可以逆轉(zhuǎn)此變化。此外，高糖誘導(dǎo)后HK-2細(xì)胞中SIRT1 mRNA表達(dá)下調(diào)，同時(shí)SIRT1和PGC-1α的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。而APS可以提高SIRT1 mRNA以及SIRT1和PGC-1α的蛋白的表達(dá)水平。Ex 527是SIRT1的抑制劑，可以特異性抑制SIRT1 表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，合用Ex 527后，APS對(duì)HK-2細(xì)胞的保護(hù)作用被明顯抑制，細(xì)胞生存率降低，LDH漏出率增加，進(jìn)一步表明APS通過(guò)SIRT1途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，APS可提高高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的生存率、維持線粒體功能并抑制線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為通過(guò)AMPK/SIRT1/PGC-1α途徑發(fā)揮對(duì)線粒體的保護(hù)作用。該研究為治療DN提供了新的治療思路，同時(shí)也為推動(dòng)中藥發(fā)展提供了理論基礎(chǔ)。