大蒜素對(duì)心肌缺血大鼠血清及心肌組織ATP酶活性、CGRP表達(dá)的影響

張正升，韓貴芝，張申，吳聯(lián)合，盛存見

1濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東濟(jì)寧272100；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院

缺血性心臟病是指由于冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起的冠狀動(dòng)脈血流和心肌需求不平衡而導(dǎo)致的心肌損害，病死率高且發(fā)病人數(shù)仍在逐漸增多，已成為中國(guó)居民死亡的首要原因[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素在對(duì)心血管治療中具有積極作用，包括抗動(dòng)脈粥樣硬化、擴(kuò)張血管、抗血小板聚集、抗氧化、降血脂等[1～3]。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是外周神經(jīng)釋放的一種神經(jīng)遞質(zhì)，參與了機(jī)體包括炎癥反應(yīng)、心血管功能調(diào)節(jié)在內(nèi)的一系列反應(yīng)機(jī)制。在急性心肌缺血的過程中，心肌內(nèi)源性CGRP增加提示CGRP可能參與或影響缺血性心臟病的病程[4,5]。ATP是細(xì)胞內(nèi)主要的高能磷酸載體，心肌組織內(nèi)ATP含量的升高可以有效誘導(dǎo)心肌收縮能力的增強(qiáng)，改善心臟的功能[6,7]。郝家榮等[8]研究表明，外源性CGRP和KATP對(duì)大鼠心臟IR的調(diào)節(jié)具有一定作用。2019年，本研究通過建立心肌缺血模型大鼠，觀察大蒜素灌胃后對(duì)血清及心肌GCRP表達(dá)和ATP酶含量的影響，探討大蒜素在缺血心肌保護(hù)作用方面的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 健康成年雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(208±15)g，由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院提供(SYXK魯20180002)。飼養(yǎng)期間大鼠自由飲食飲水，保證定時(shí)通風(fēng)光照，室溫控制在22～25 ℃。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。大鼠ATP酶聯(lián)免疫試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，大鼠CGRP酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物科技研究所)，大蒜油(江西鑫森天然藥用油有限公司)，99%鹽酸異丙腎上腺素(上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司)。BioTek ELx808酶標(biāo)儀，Bertin Precellys 24生物樣品均質(zhì)器、Blabotery PYL-70恒溫箱，低溫冷凍離心機(jī)。

1.2 模型制備及動(dòng)物分組 將48只大鼠腹腔注射異丙腎上腺素3 mg/kg，2次/d，連續(xù)20 d，建立大鼠心肌缺血模型。檢測(cè)心電圖，以病理性Q波形成為模型制備成功[9]。將心肌缺血模型建立成功的大鼠隨機(jī)分為高劑量組、中劑量組、低劑量組和模型組，每組各12只。另選擇12只正常大鼠腹腔注射等容量的生理鹽水，作為空白組。

1.3 干預(yù)方法 對(duì)高劑量組、中劑量組、低劑量組分別用56.25、112.5、225 mg/(kg·d)的大蒜素灌胃，模型組和空白組用等容量的豆油進(jìn)行灌胃。30 d時(shí)處死取樣。

1.4 血清ATP、CGRP水平檢測(cè) 麻醉后摘眼球取血3～6 mL，室溫血液自然凝固，3 000 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃冷藏。采用ELISA法檢測(cè)血清ATP、CGRP水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行操作，最后用BioTek ELx808酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)測(cè)每孔OD值。

1.5 心臟質(zhì)量、心臟指數(shù)測(cè)定 大鼠取血后，準(zhǔn)確稱體質(zhì)量并記錄。麻醉后脫臼處死，75%乙醇浸泡消毒后解剖取出心臟，準(zhǔn)確稱量并記錄。計(jì)算心臟指數(shù)=心臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.6 心臟組織形態(tài)觀察 取左心室心尖處1～2 mm心肌組織，于4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm切片，HE染色行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.7 心肌組織ATP、CGRP含量檢測(cè) 準(zhǔn)確稱1.0 g左心室組織，加入1 mL的預(yù)冷裂解液行研磨勻漿，勻漿后以3 000 r/min離心10 min后取上清，-20 ℃冷藏，采用ELISA法檢測(cè)心肌組織ATP、CGRP含量。

2 結(jié)果

2.1 各組血清ATP、CGRP水平比較 各組血清ATP、CGRP水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組血清ATP、CGRP水平比較

2.2 各組心臟質(zhì)量、心臟指數(shù)比較 各組大鼠體質(zhì)量及心臟質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。模型組心臟指數(shù)高于空白組，高劑量組、中劑量組、低劑量組心臟指數(shù)均高于模型組(P均<0.05)。高劑量組、中劑量組、低劑量組心臟指數(shù)隨大蒜素劑量的增加呈降低趨勢(shì)(r=-0.357，P=0.026)。見表2。

表2 各組心臟質(zhì)量、心臟指數(shù)比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.3 各組心肌組織形態(tài)變化 空白對(duì)照組心肌纖維排列整齊清晰；模型組心肌肥厚，且心肌組織纖維排列模糊紊亂，間質(zhì)纖維增生水腫，有明顯的炎癥浸潤(rùn)。大蒜素高劑量組心肌纖維排列不整齊，部分有較少量的纖維增生，心肌細(xì)胞排列較精密，炎癥較模型組減輕。

2.4 各組心肌組織ATP酶活性、CGRP含量比較 模型組心肌組織ATP酶活性、CGRP含量均低于空白組(P均<0.05)；各劑量組心肌組織ATP酶活性均高于模型組(P均<0.05)。高劑量組、中劑量組心肌組織CGRP含量均高于模型組(P均<0.05)，且心肌組織CGRP含量與大蒜素的劑量呈依賴性(r=0.342，P=0.031)。見表3。

表3 各組心肌組織ATP、CGRP含量比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.5 大蒜素干預(yù)后心肌組織ATP、CGRP含量的相關(guān)性 大蒜素干預(yù)后，心肌組織ATP含量與CGRP呈正相關(guān)(r=0.246，P=0.029)。

3 討論

缺血性心臟病又稱冠狀動(dòng)脈性心臟病，是指由于冠狀動(dòng)脈血管病變，血管向心肌輸送血液不足造成心肌缺血肥大，從而造成患者心絞痛、心肌梗死等癥狀。冠狀動(dòng)脈梗死再通是治療缺血性心臟病的主要手段，但其術(shù)中帶來(lái)的心肌缺血—再灌注損傷(IR)則會(huì)嚴(yán)重影響手術(shù)效果及愈后結(jié)果，甚至?xí)斐苫颊咝穆刹积R誘發(fā)患者死亡[10]。

大蒜性味辛溫，歸陽(yáng)明、太陰、厥陰經(jīng)，具有行滯氣、通五臟、達(dá)諸竅、化癥積、破惡血、除風(fēng)邪等作用?！侗静菥V目》亦記載大蒜“搗汁飲，治吐血心痛”[11]。大蒜素又名大蒜新素，是大蒜球莖中分離出的一種化合物，為大蒜的主要有效成分，化學(xué)名為二烯丙基三硫化物。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)大蒜素的藥理、臨床觀察、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等多方面做出了研究，發(fā)現(xiàn)大蒜素在對(duì)心血管治療中的積極作用，包括抗動(dòng)脈粥樣硬化、擴(kuò)張血管、抗血小板聚集、抗氧化、降血脂等方面的生物學(xué)價(jià)值[12]。喬蕾等[12]研究表明，大蒜素對(duì)心肌的保護(hù)機(jī)制主要是增加心肌的抗氧化能力，同時(shí)對(duì)冠狀動(dòng)脈梗塞再通術(shù)中的IR具有保護(hù)意義，可能通過對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來(lái)保護(hù)缺血心肌，但具體機(jī)制仍有待探討。周宏等[13]研究表明，缺血性心臟病與線粒體來(lái)源活性氧過載密切相關(guān)，而線粒體氧化磷酸化是ATP合成的基本機(jī)理，提示ATP與缺血性心臟病的病理變化過程存在一定聯(lián)系。ATP敏感性鉀通道(KATP)在豚鼠的心肌細(xì)胞上被首次發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血、梗死時(shí)該通道起到了保護(hù)作用，隨著ATP濃度的升高KATP的活性隨之減弱[14]。本研究結(jié)果表明，模型組心肌肥厚，且心肌組織纖維排列模糊紊亂，間質(zhì)纖維增生水腫，有明顯的炎癥浸潤(rùn)；而大蒜素各劑量組心肌組織炎癥較模型組減輕，表明大蒜素能夠促進(jìn)心肌損傷的修復(fù)，發(fā)揮保護(hù)心肌的功能。本研究結(jié)果表明，模型組心肌組織ATP、CGRP水平均低于空白組，表明心肌損傷時(shí)CGRP與ATP的釋放可能被抑制，各劑量組心肌組織CGRP含量均高于模型組，提示大蒜素可以刺激心血管釋放更多的血管收縮因子CGRP，從而起到對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用，且大蒜素對(duì)大鼠缺血心肌的保護(hù)作用隨著大蒜素濃度的升高而增強(qiáng)；各劑量組心肌組織ATP酶活性均高于模型組，表明大蒜素對(duì)大鼠心肌功能的保護(hù)作用與誘導(dǎo)心肌中ATP產(chǎn)生有關(guān)；心肌組織CGRP與ATP含量呈正相關(guān)，表明大蒜素對(duì)缺血心肌的保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞電生理功能恢復(fù)，從而提高心肌組織中ATP含量，增強(qiáng)心血管的活動(dòng)能力，增強(qiáng)其釋放CGPR因子的能力有關(guān)。

綜上所述，大蒜素對(duì)心肌缺血具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能為誘導(dǎo)ATP酶活性的升高以及增強(qiáng)心肌組織中神經(jīng)調(diào)節(jié)因子CGRP表達(dá)有關(guān)，一定劑量的大蒜素能促進(jìn)心肌細(xì)胞電生理功能恢復(fù)正常，增強(qiáng)血管舒張能力，增加心肌的供血，緩解心肌缺血的癥狀。