高原肺水腫大鼠肺組織差異表達(dá)microRNA的篩選、生物學(xué)功能分析及驗(yàn)證

劉三立，蔡未，劉子泉，侯世科，樊毫軍，丁輝

1中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津300162；2中國(guó)人民解放軍98985部隊(duì)衛(wèi)生連；3天津大學(xué)災(zāi)難醫(yī)學(xué)研究院

高原肺水腫是發(fā)生在健康人群快速進(jìn)入海拔2 500 m以上高度時(shí)常出現(xiàn)的威脅生命的急性并發(fā)癥[1, 2]。高原肺水腫起病急，進(jìn)展快，如救治不及時(shí)，可在較短時(shí)間內(nèi)發(fā)展至呼吸衰竭甚至死亡，病死率36.36%～90%[3]，是嚴(yán)重威脅高原人群健康和生命的急性重癥高原病。個(gè)體所處的海拔高度、上升速率、預(yù)適應(yīng)能力及其易感性是導(dǎo)致高原肺水腫發(fā)生的主要因素[4]。張西南等[5]發(fā)現(xiàn)，385例急性高原病患者中重型高原病175例，死亡5例，病死率1.3%。我國(guó)高原面積大，常駐人口多，如何預(yù)防高原肺水腫的發(fā)生及減輕其嚴(yán)重程度是高原醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重大課題。

microRNA(miRNA)是一組21～25 nt長(zhǎng)的非編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，能通過(guò)堿基配對(duì)與mRNA分子的3′UTR相結(jié)合，降解mRNA或抑制靶基因的翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控。2007年，Kulshreshtha 等[6]首次報(bào)道了缺氧與miRNA的關(guān)系，采用基因芯片技術(shù)篩選出了27個(gè)缺氧相關(guān)miRNA。Alam 等[7]首次研究了miRNA在高原肺水腫病理生理方面發(fā)揮的重要作用。大量缺氧介導(dǎo)的差異表達(dá)miRNA參與了與高原肺水腫發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的諸如離子通道、肺動(dòng)脈高壓、血管功能和應(yīng)激反應(yīng)等的調(diào)控過(guò)程，表明高原肺水腫受miRNA遺傳調(diào)控作用的影響。2018年12月～2019年6月，本研究在低氧暴露不同時(shí)間條件下，建立穩(wěn)定大鼠高原肺水腫模型，運(yùn)用基因芯片技術(shù)篩選出差異表達(dá)高原肺水腫大鼠與健康大鼠肺組織差異表達(dá)miRNA，并進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)及miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析和生物學(xué)信息分析，揭示這些差異表達(dá)miRNA與高原肺水腫的內(nèi)在聯(lián)系，為探索高原肺水腫發(fā)病機(jī)制提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑、儀器 SPF級(jí)成年雄性SD大鼠24只(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)，體質(zhì)量180～200 g；芯片類(lèi)型：miRNA 4.0 Rat(美國(guó)Affymetrix公司)：GeneChip WT Terminal Labeling and Controls Kit、Ambion WT Expression Kit、GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit；芯片設(shè)備、軟件(美國(guó)Affymetrix公司)：基因芯片洗脫工作站GeneChip Fluidics Station 450、基因芯片雜交爐GeneChip Hybridization Oven 645、基因芯片掃描儀GeneChip Scanner 3000 7G、GeneChip GCOS軟件Affymetrix GeneChip Operating Software；TRIzol RNA提取試劑(美國(guó)invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，SYBR Green預(yù)混液(日本TaKaRa公司)，IL-6、TNF-α、IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，BCA總蛋白試劑盒(北京索萊寶公司)，熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-RAD公司)，超微量紫外分光光度計(jì)(德國(guó)implen公司)，DMI3000B生物倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 高原肺水腫大鼠模型建立及鑒定 將大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組和低氧24、48、72 h組，每組6只。低氧組使用數(shù)字化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙(武警后勤學(xué)院)模擬6 000 m低壓低氧環(huán)境，運(yùn)行時(shí)間依據(jù)每次造模時(shí)間設(shè)置，設(shè)置艙內(nèi)溫度為(10±2)℃，濕度保持在(60±10)%，艙內(nèi)汞壓 54.5 kPa，氧濃度 9.76%，氧分壓9.9 kPa，泵切換時(shí)間720 min，高度上升/下降速率為10 m/s，啟動(dòng)制冷開(kāi)啟模式。對(duì)照組在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)72 h。造模完成后，各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥(2 mL/0.1 kg)麻醉，取仰臥位固定。經(jīng)會(huì)陰上方腹部正中做縱行切口，充分暴露腹腔后，腹主動(dòng)脈抽取2 mL動(dòng)脈血。采集的血樣本4 ℃、3 000 r/min、離心后取血清保存于-80 ℃冰箱，采用ELISA法檢測(cè)IL-6、TNF-α、IL-10。打開(kāi)胸腔結(jié)扎右主支氣管，氣管插管通過(guò)左主支氣管向左肺緩緩注入生理鹽水4 mL，緩慢回抽生理鹽水再重新注入，重復(fù)沖洗2～3次，將收集到的肺泡灌洗液(BALF)800 g，4 ℃離心10 min，保留上清液，采用ELISA法檢測(cè)IL-6、TNF-α、IL-10。分離右肺，右上葉用于測(cè)量肺組織含水量，右中葉用4%多聚甲醛固定用于肺組織HE染色，右下葉-80 ℃低溫冰箱中保存，進(jìn)行后續(xù)miRNA芯片分析。低氧24、48、72 h組及對(duì)照組血清IL-6水平分別為(68.20±9.66)、(99.83±13.10)、(88.39±14.71)、(37.03±14.22)pg/μL；TNF-α水平分別為(218.19±25.76)、(311.08±34.91)、(281.68±32.92)、(173.95±24.04)pg/μL；IL-10水平分別為(39.34±4.51)、(54.05±7.57)、(64.70±8.22)、(23.98±5.91)pg/μL。低氧24、48、72 h組及對(duì)照組BALF中IL-6水平分別為(105.25±9.38)、(145.39±17.25)、(129.83±14.16)、(79.86±15.29)pg/μL；TNF-α水平分別為(303.94±27.79)、(370.14±34.00)、(365.74±19.58)、(260.61±29.92)pg/μL；IL-10水平分別為(53.88±5.40)、(66.47±6.48)、(79.21±9.82)、(38.37±5.34)pg/μL。低氧24、48、72 h組及對(duì)照組總蛋白量分別為(0.36±0.10)、(0.39±0.13)、(0.38±0.03)、(0.20±0.05)mg/μL。低氧24、48、72 h組及對(duì)照組肺含水量分別為0.79±0.01、0.80±0.02、0.80±0.01、0.78±0.02。與對(duì)照組相比，低氧24、48、72 h組血清和BALF中IL-6、IL-10、TNF-α水平升高，BALF中總蛋白含量增多(P均<0.01)。與對(duì)照組相比，低氧48、72 h組肺組織含水量增加(P均<0.05)。病理染色結(jié)果示，各低氧組表現(xiàn)出明顯的肺泡及間質(zhì)水腫、肺泡間隔增厚伴紅細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性滲出。以上結(jié)果提示高原肺水腫模型成功建立。

1.3 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達(dá)miRNA篩選、靶基因預(yù)測(cè)及其相互作用分析 利用miRNA 4.0-Rat芯片(美國(guó)Affymetrix公司)對(duì)肺組織miRNA進(jìn)行篩選。取1 μg 肺組織總RNA進(jìn)行樣本RNA質(zhì)量檢測(cè)。總RNA加尾后，加入FlashTag Biotin HSR Ligation Mix(美國(guó)Affymetrix公司)至已加尾混合液中按照廠家說(shuō)明進(jìn)行生物素標(biāo)記和純化，用GeneChip Hybridization Oven 645(美國(guó)Affymetrix公司)與Affymetrix miRNA 4.0 microarray(美國(guó)Affymetrix公司)雜交，用GeneChip Fluidics Station 450(美國(guó)Affymetrix公司)進(jìn)行芯片洗脫，然后用GeneChip Scanner 3000 7G(美國(guó)Affymetrix公司)掃描芯片。原始數(shù)據(jù)由GeneChip GCOS(美國(guó)Affymetrix公司)分析處理，差異表達(dá)miRNA比較，P<0.05, FC>2.0被認(rèn)為是差異基因。采用miRanda和TargetScan 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，最后對(duì)兩種預(yù)測(cè)的結(jié)果取交集以增加結(jié)果的可靠性。

1.4 大鼠肺組織差異表達(dá)miRNA基因本體功能(GO)及信號(hào)通路分析 將以上得到的差異表達(dá)miRNA靶基因基于 GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋?zhuān)琄EGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)通路注釋?zhuān)@著性篩選的標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05。

1.5 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達(dá)miRNA檢測(cè) 在連續(xù)上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)miRNA中選擇相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度上調(diào)較為明顯和相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度下調(diào)較明顯者進(jìn)行qPCR。使用TRIzol試劑提取樣本組織總RNA。RNA在260 nm處通過(guò)吸光度定量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。qPCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。采用U6作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示目的基因表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達(dá)miRNA 以FC>2.0為準(zhǔn)，篩選出的差異表達(dá)miRNA有14種，其中上調(diào)的有5種，分別為rno-miR-324-5p、rno-miR-6215、rno-miR-3473、rno-miR-344g、rno-miR-541-5p；下調(diào)的有9種，分別為rno-miR-3544、rno-miR-322-3p、rno-miR-203a-3p、rno-miR-342-5p、rno-miR-3556b、rno-miR-532-5p、rno-miR-101a-5p、rno-miR-361-3p、rno-miR-187-3p。在這些差異表達(dá)miRNA中，隨著時(shí)間推移，表達(dá)量持續(xù)上調(diào)和下調(diào)的miRNA有5種。其中上調(diào)的有2種，分別為rno-miR-344g和rno-miR-541-5p，四組之間rno-miR-541-5p比較，低氧72 h組<低氧24 h組、低氧48 h組、對(duì)照組(P均<0.05)，而低氧48 h、低氧24 h組與對(duì)照組之間比較，P均>0.05；四組之間rno-miR-344g比較，P>0.05。下調(diào)的有3種，分別為rno-miR-3556b、rno-miR-101a-5p、rno-miR-361-3p，四組rno-miR-3556b比較：低氧48、72 h組<對(duì)照組(P均<0.05)；四組rno-miR-101a-5p、rno-miR-361-3p比較：低氧48、72 h組<低氧24 h組、對(duì)照組(P均<0.05)。

2.2 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果及其對(duì)靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 低氧組與常氧組差異表達(dá)miRNA靶基因在miRanda和TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)中的交集較多。差異miRNA調(diào)控的靶基因很多，如：rno-miR-344g(76個(gè))、rno-miR-541-5p(111個(gè))、rno-miR-3556b(5個(gè))、rno-miR-361-3p(198個(gè))、rno-miR-101a-5p(48個(gè))、rno-miR-187-3p(19個(gè))、rno-miR-203a-3p(113個(gè))、rno-miR-322-3p(36個(gè))、rno-miR-324-5p(77個(gè))、rno-miR-342-5p(32個(gè))、rno-miR-3473(50個(gè))、rno-miR-3544(39個(gè))、rno-miR-532-5p(58個(gè))、rno-miR-6215(15個(gè))。同時(shí)，這些miRNA之間存在多個(gè)相互關(guān)聯(lián)的靶基因。其中，rno-miR-203a-3p與rno-miR-541-5p的交互靶基因有1個(gè)(Nrp1)，與rno-miR-324-5p的交互靶基因有1個(gè)(Med22)，與rno-miR-322-3p的交互靶基因有1個(gè)(Plekhh2)，與rno-miR-3544的交互靶基因有1個(gè)(Parg)；rno-miR-101a-5p與rno-miR-541-5p的交互靶基因有1個(gè)(Rora)，與rno-miR-361-3p的交互靶基因有2個(gè)(Ldoc1l、Pnoc)，與rno-miR-187-3p的交互靶基因有1個(gè)(Naa38)；rno-miR-541-5p與rno-miR-361-3p的交互靶基因有1個(gè)(Dcx)，與rno-miR-342-5p的交互靶基因有2個(gè)(Lrch1、Slc1a2)，與rno-miR-532-5p的交互靶基因有1個(gè)(C1orf21)；rno-miR-361-3p與rno-miR-324-5p的交互靶基因有2個(gè)(Scn2b、Lama4)，與rno-miR-322-3p的交互靶基因有2個(gè)(Otud3、Zc3h13)，與rno-miR-3544的交互靶基因有2個(gè)(Tle3、Ube2d4)，與rno-miR-3473的交互靶基因有1個(gè)(Zbtb24)，與rno-miR-344g的交互靶基因有1個(gè)(Sbno1); rno-miR-324-5p與miR-3473的交互靶基因有1個(gè)(Hoxb3)；rno-miR-3473與rno-miR-532-5p的交互靶基因有1個(gè)(Znf652)；rno-miR-532-5p與rno-miR-344g的交互靶基因有1個(gè)(Bsnd)；rno-miR-344g與rno-miR-6215的交互靶基因有1個(gè)(Pmfbp1)。

2.3 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達(dá)miRNA的基因本體功能及信號(hào)通路 高原肺水腫大鼠肺組織差異表達(dá)miRNA參與的生物學(xué)過(guò)程有66種，主要涉及核酸的調(diào)控如RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控(GO:0000122)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控(GO:0006357)等，蛋白泛素化如蛋白K63有關(guān)泛素化(GO:0070534)、蛋白K6有關(guān)泛素化(GO:0070534)等，信號(hào)通路如Wnt信號(hào)通路(GO:0016055)、胞內(nèi)受體信號(hào)通路(GO:0030522)等，血管生理如血管發(fā)育(GO:0001568)、血管新生(GO:0001525)等以及生物進(jìn)程如大腦發(fā)育(GO:0007420)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育(GO:0007399)等。在細(xì)胞的組成成分層面有28種，主要涉及細(xì)胞內(nèi)組成如核漿(GO:0005654)、胞質(zhì)(GO:0005829)等，細(xì)胞器如蛋白復(fù)合體(GO:0043234)、多核糖體(GO:0005844)等，細(xì)胞膜如基膜(GO:0005605)、膜組成部分(GO:0005887)，細(xì)胞功能如神經(jīng)元投射(GO:0043005)、細(xì)胞黏附連接(GO:0005913)等。在基因分子功能層面有30種，主要涉及與生物分子有關(guān)的結(jié)合如蛋白結(jié)合(GO:0019901)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(GO:0033613)等，生物分子的活性如泛素蛋白轉(zhuǎn)移活性(GO:0004842)、氯離子通道活性(GO:0005254)，分子功能(GO:0003674)等。差異表達(dá)miRNA涉及的信號(hào)通路有11種，主要有PI3K-Akt信號(hào)通路(pathway ID：rno04151)、癌癥通路(pathway ID：rno05200)、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路(pathway ID：rno04512)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路(pathway ID：rno04141)、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用通路(pathway ID：rno04120)等。

2.4 四組關(guān)鍵差異miRNA 比較 在5種連續(xù)上調(diào)和下調(diào)的高原肺水腫大鼠肺組織差異表達(dá)miRNA中選擇相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度上調(diào)較為明顯的rno-miR-541-5p，和相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度下調(diào)較為明顯的rno-miR-101a-5p進(jìn)行熒光定量qPCR驗(yàn)證。低氧72 h組、低氧48 h組、低氧24 h組、對(duì)照組rno-miR-541-5p分別為1.72±0.18、1.43±0.36、1.46±0.14、1，rno-miR-101a-5p分別為0.64±0.23、0.46±0.25、0.91±0.23、1。與對(duì)照組相比，rno-miR-541-5p在低氧暴露各組相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P均<0.05);與對(duì)照組相比，rno-miR-101a-5p在低氧暴露組相對(duì)表達(dá)量下降，其中低氧48 h組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低氧24 h組與低氧48 h組比較，P<0.05。與miRNA芯片結(jié)論一致。

3 討論

當(dāng)個(gè)體在適應(yīng)高原環(huán)境的過(guò)程中，機(jī)體的基因表達(dá)會(huì)發(fā)生一系列變化，以平衡缺氧引起的應(yīng)激，其調(diào)控元件如miRNA參與了高原肺水腫的發(fā)展過(guò)程。文獻(xiàn)報(bào)道了多種miRNA參與調(diào)控了急性肺損傷的發(fā)生，并可能成為分子治療的潛在靶標(biāo)。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)藥物靶向miR-381介導(dǎo)的NLRP3的表達(dá)，能夠減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。Zhou等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-126-3p的過(guò)表達(dá)能夠抑制炎癥蛋白HMGB1和血管通透性因子VEGF-A，增加緊密連接蛋白的表達(dá)。Zhang等[10]證實(shí)了miR-96和miR-330均可通過(guò)與AQP5的3′-非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)AQP5的表達(dá)，從而減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺水腫。有研究[11, 12]發(fā)現(xiàn)，miR-144和miR-155被認(rèn)為是兩種相互拮抗的miRNA，miR-144可減弱肺血管中ROCK1/MLC通路的激活，起到抗炎作用，而在miR-155基因敲除的小鼠中，Ang-2- Tie-2-MLC信號(hào)通路活性降低，炎癥相關(guān)蛋白被下調(diào)，表明miR-155對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷具有促進(jìn)作用。相關(guān)研究表明，miR-16、miR-20b，miR-22、miR-206和miR-17/92在低氧暴露中表達(dá)下調(diào)，抑制離子通道并增加肺動(dòng)脈壓，從而導(dǎo)致血管功能障礙和細(xì)胞完整性喪失。而miR-23b，miR-26a和miR-155抑制TGF信號(hào)傳導(dǎo)并導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓升高，miR-210能夠抑制線粒體功能，這些生理功能與高原肺水腫密切相關(guān)，表明高原肺水腫是一種器官特異性(肺)和環(huán)境應(yīng)激誘導(dǎo)的疾病[7]。

本研究在建立低氧暴露24、48、72 h模型的基礎(chǔ)上，運(yùn)用基因芯片技術(shù)，以FC>2.0為標(biāo)準(zhǔn)，選取了14種差異表達(dá)miRNA，其中上調(diào)的有5種，下調(diào)的有9種。miRNA對(duì)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，上述miRNA存在多種交互基因如Scn2b、Lama4、Hoxb3、Zc3h13等，預(yù)測(cè)它們可能共同參與調(diào)控了高原肺水腫的發(fā)生發(fā)展，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。進(jìn)一步篩選分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在低氧24、48、72 h組表達(dá)量連續(xù)上調(diào)或下調(diào)的miRNA有5種，其中上調(diào)的miRNA有rno-miR-344g和rno-miR-541-5p,下調(diào)的miRNA有rno-miR-3556b、rno-miR-101a-5p、rno-miR-361-3p。說(shuō)明上述5種miRNA在低氧暴露的同時(shí)，隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間相關(guān)性，其在低氧中的上調(diào)或下調(diào)影響著特定靶基因表達(dá)的增加或降低，可能發(fā)揮著諸如改變細(xì)胞整合和屏障功能、血管滲透性等高原肺水腫的病理生理因素等[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-541-5p與肺纖維化的發(fā)生有關(guān)，其通過(guò)在蛋白翻譯水平上調(diào)節(jié)PDE1A的表達(dá)而成為肺成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵因子，同時(shí)，我們通過(guò)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)RORα是rno-miR-101a-5p參與血管新生的靶基因之一，這兩種在本研究中上調(diào)和下調(diào)較為明顯的miRNA 是否也通過(guò)特定機(jī)制發(fā)揮對(duì)高原肺水腫的調(diào)控作用，有待進(jìn)一步研究[13～15]。

低氧是引起高原肺水腫的重要因素，高原引發(fā)肺水腫的發(fā)生機(jī)制主要有：①低氧引起肺動(dòng)脈強(qiáng)烈收縮、肺血管損傷、通透性增加導(dǎo)致液體滲入肺泡增多，肺水腫形成；②低氧誘導(dǎo)免疫因子和炎癥因子增多，促進(jìn)肺動(dòng)脈血管通透性增加；③低氧抑制Na+-K+-ATP酶活性，引起肺泡上皮細(xì)胞鈉離子和水等清除障礙，導(dǎo)致肺組織水潴留[16, 17]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路可以改善內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能障礙。鄧旺等[18, 19]研究發(fā)現(xiàn)，激活PI3K /Akt 信號(hào)通路能上調(diào)ENaC的表達(dá)，清除急性肺損傷時(shí)肺內(nèi)多余的水腫液，從而減輕肺組織損傷，表明PI3K/Akt信號(hào)通路在調(diào)節(jié)肺水腫方面發(fā)揮著重要作用。Villar等[20]在大鼠COPD模型中發(fā)現(xiàn)抑制Wnt信號(hào)通路可減輕肺組織損傷，改善肺功能并重新建立肺泡上皮細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，說(shuō)明Wnt信號(hào)通路影響著肺泡-毛細(xì)血管屏障的通透性。在本研究中，我們通過(guò)信號(hào)通路的顯著性分析發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)Wnt、PI3K/Akt信號(hào)通路也具有相關(guān)調(diào)控作用，說(shuō)明篩選出的相關(guān)miRNA可能通過(guò)調(diào)控特定信號(hào)通路對(duì)高原肺水腫的產(chǎn)生起到正性或負(fù)性調(diào)節(jié)作用。此外，通過(guò)對(duì)14種miRNA的靶基因進(jìn)行關(guān)于細(xì)胞組分、分子功能、生物過(guò)程的富集分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-101a-5p、miR-203a-3p、rno-miR-361-3p、rno-miR-541-5p、rno-miR-324-5p、rno-miR-344g、rno-miR-532-5p、rno-miR-3473等具有調(diào)控血管新生的功能，而血管新生可以誘導(dǎo)肺毛細(xì)血管通透性的增加導(dǎo)致肺水腫的發(fā)生[21, 22]。結(jié)合本研究對(duì)miRNA的生物信息學(xué)分析，我們推斷高原低氧下差異表達(dá)的miRNA參與了對(duì)高原肺水腫的調(diào)控過(guò)程。

綜上所述，在高原肺水腫大鼠肺組織中差異表達(dá)miRNA有14種，其中持續(xù)上調(diào)的有rno-miR-344g、rno-miR-541-5p，下調(diào)的有rno-miR-3556b、rno-miR-101a-5p、rno-miR-361-3p。這些miRNA之間存在許多交互靶基因，并與其靶基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。主要參與核酸的調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程，影響細(xì)胞內(nèi)組成如核漿、胞質(zhì)等，涉及生物分子有關(guān)的結(jié)合，相關(guān)的信號(hào)通路主要有PI3K-Akt信號(hào)通路等。高原肺水腫大鼠肺組織中差異表達(dá)miRNA及其靶基因參與了諸如血管新生、血管發(fā)育、細(xì)胞黏附連接、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、PI3K-Akt信號(hào)通路等與高原肺水腫形成機(jī)制緊密相關(guān)的細(xì)胞分子生物學(xué)過(guò)程，表明這些差異表達(dá)miRNA可能參與調(diào)控了高原肺水腫發(fā)生的可能機(jī)制，這為進(jìn)一步探索高原肺水腫發(fā)病機(jī)制及其預(yù)防治療提供了新思路。