CPNE1通過c-MET調(diào)控非小細胞肺癌的增殖

楊 雯 杜雯雯 張 楊 劉澤毅 黃建安

CPNE1是1種非小細胞肺癌的致癌基因，它可以促進腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲。CPNE1的高表達與腫瘤進展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移(TNM)顯著相關(guān)，同時提示著低生存率[1]。Copine1由CPNE1基因編碼，主要位于細胞膜和細胞質(zhì)中，屬于copines蛋白大家族中的一員。copines蛋白是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白的1個家族，存在于各種真核生物和原生生物中，它是1種可溶性膜結(jié)合蛋白，包括N端的兩個串聯(lián)C2結(jié)構(gòu)域和C端的A結(jié)構(gòu)域[2]。C2結(jié)構(gòu)域作為鈣依賴性磷脂結(jié)合基序，與細胞信號傳導和膜傳導途徑有關(guān)[3]。A結(jié)構(gòu)域可與多種細胞內(nèi)蛋白結(jié)合，作為蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用[4]。

c-MET是非小細胞肺癌中繼EGFR和ALK之后又一新的治療靶點。c-MET原癌基因位于人類第7號染色體的長臂 (7q21-31)[5]，蛋白產(chǎn)物是c-MET酪氨酸激酶受體(HGFR)，c-MET的配體是肝細胞生長因子(HGF)，能夠促進細胞的增殖、存活、遷移、分化和形態(tài)改變[6]。在腫瘤中，c-MET受體可以與高選擇性配體HGF結(jié)合而發(fā)生磷酸化激活，通過激活下游的STAT、PI3K/mTOR、和MAPK信號通路，從而促進細胞的增殖、存活、轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成，最終引起疾病進展[7]。

查閱文獻發(fā)現(xiàn)，目前尚無關(guān)于CPNE1和c-MET兩種基因在腫瘤中相互作用的研究，本文章旨在探索CPNE1與c-MET癌基因?qū)Ψ切〖毎伟┑陌l(fā)生發(fā)展及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

從中國科學院細胞庫(上海)采購人NSCLC細胞A549、H1299、SPC-A1、HCC827、PC9、H1975(肺腺癌細胞系)、H226(肺鱗癌細胞系)H460(大細胞肺癌細胞)和BEAS-2B(人永生化正常上皮細胞)。

1.2 主要儀器

熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，PCR擴增儀(德國Eppendorf 公司)，Western blot儀(Bio-Rad)、酶標儀(Thermo)。

1.3 主要試劑

RPMI-1640、DMEM、FBS(美國Gibco 公司)，超敏ECL發(fā)光液(美國Thermo公司)，胰蛋白酶(美國HyCone公司),CPNE1慢病毒(abm公司)，jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑(法國polyplus公司)。

1.4 Western Blot相關(guān)抗體

CPNE1購于Santa Cruz,CA,USA,p-AKT(Ser473)(D9E),AKT,ERK(137F5),p-ERK(Thr202/Tyr202)(D13.14.4E)購于Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA;β-actin和二抗來自Cell Signaling Technology，Danvers,MA,USA。

1.5 RNA干擾序列

兩個針對CPNE1不同編碼區(qū)的si-RNA序列(GenePharma)。靶序列如下siRNA-CPNE1-1:5'-GGACUUCACUGGCUCCAAUTT-3'(sense) and 5'-AUUGGAGCCAGUGAAGUCCTT-3'(antisense);siRNA-CPNE1-2:5'-GCAGGUCUCGCAUGAAUUUTT-3'(sense)and 5'-AAAUUCAUGCGAGACCUGCTT-3'(antisense)。用于c-met基因檢測的引物序列：siRNA-MET:5'-GUGCAGUAUCCUCUGACAGTT-3'(sense) and 5'-CUGUCAGAGGAUACUGCACTT-3'(antisense)。

1.6 方法

1.6.1 細胞培養(yǎng) 細胞在含10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(50 U/ml青霉素和鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)基中及5% CO2的濕潤環(huán)境中生長。

1.6.2 RNA干擾 干擾序列5 μl加入jetPRIME buffer(Polyplus)200 μl震蕩離心混勻，再加入4 μl(jetPRIME buffer(Polyplus)震蕩混勻，感染細胞4 h更換培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染72 h后，收取細胞RNA及蛋白用于進一步的實驗。

1.6.3 過度表達CPNE1的穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建 為了產(chǎn)生CPNE1穩(wěn)定過度表達的非小細胞肺癌細胞，合成了1626 bp的CPNE1編碼序列片段(中國蘇州，genewiz)，并利用內(nèi)切酶ecori和xbai通過慢病毒釋放系統(tǒng)(Clontech，Mountain View，CA，USA)亞克隆到PLVX-IRES新載體中進行表達。用脂質(zhì)體fectamine 2000(invitrogen)將CPNE1表達結(jié)構(gòu)與包裝老化質(zhì)粒共導入人胚胎腎293 T細胞。人胚胎腎293T細胞在含10%FBS的Dulbecco改良Eagle's培養(yǎng)基中37 ℃下在濕潤的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)后收集包裝好的慢病毒，用于感染A549和HCC827細胞。2天后，用400 μg/ml的G418(Amresco，Solon，OH，USA)篩選穩(wěn)定細胞。

1.6.4 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細胞的增殖能力 正常培養(yǎng)各組細胞，0.25% EDTA-胰酶消化細胞，計數(shù)并按約3.0×103個細胞接種于96孔板各孔中，每孔100 μl完全培養(yǎng)基，每組細胞設(shè)置3個復孔，注意96孔板周圍一圈加PBS緩解細胞培養(yǎng)基蒸發(fā)。然后置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在24、48、72 h向每個孔中加入10 μl CCK-8檢測試劑，注意在孔中不能有氣泡。37 ℃靜置4 h，使用酶標儀于450 nm、630 nm處檢測各孔OD值。

1.6.5 RNA提取及定量 實時PCR分析、Western blot、克隆形成方法詳見參考文獻[1]。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 CPNE1和c-MET在非小細胞肺癌細胞系中的表達

通過Western blot分析了8個NSCLC細胞系和BEAS-2B細胞中CPNE1蛋白和p-MET蛋白的表達(圖1)。與正常細胞相比，非小細胞肺癌細胞系中CPNE1表達明顯增加，p-MET在正常細胞和腫瘤細胞株中均有表達?？梢园l(fā)現(xiàn)在A549和HCC827細胞中CPNE1和c-MET的表達量均有表達，后續(xù)選定該兩株細胞進行實驗。

圖1 CPNE1和c-MET在非小細胞肺癌細胞系中的表達

2.2 過表達CPNE1可以促進腫瘤細胞的增殖

通過慢病毒載體構(gòu)建CPNE1過表達的細胞，RT-PCR和Western blot顯示，與NC組相比， 過表達組CPNE1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高(圖2)，證實CPNE1過表達細胞株構(gòu)建成功。行CCK8和克隆形成實驗，結(jié)果顯示 CPNE1的高表達可以促進細胞的增殖(圖3)。

圖2 CPNE1過表達細胞株的構(gòu)建

圖3 過表達CPNE1能促進細胞的增殖

2.3 CPNE1通過激活c-MET促進腫瘤細胞增殖的機制

為了進一步探索CPNE1促進細胞增殖的機制，進行Western blot實驗，結(jié)果顯示，過表達CPNE1可以上調(diào)p-MET及其下游的p-AKT、p-ERK信號蛋白，而這些蛋白與細胞增殖相關(guān)。以上結(jié)果說明，CPNE1可以有效激活c-MET及其下游的p-AKT、p-ERK，從而促進細胞的增殖。這一結(jié)果在野生型A549和EGFR突變型細胞株HCC827中均得到證實(圖4)。

3 討論

有研究表明，CPNE1是非小細胞肺癌發(fā)生的關(guān)鍵因素，是1種促進體外腫瘤細胞生長、遷移和侵襲能力的癌基因。在前列腺癌組織和骨肉瘤組織中，CPNE1的表達水平亦高于正常組織[8-9]。且CPNE1的高表達與前列腺癌病人的分期、Gleason評分和較差的無復發(fā)生存率相關(guān)[9]。在copine家族中發(fā)現(xiàn)，CPNE3上調(diào)也能增強NSCLC的細胞轉(zhuǎn)移[10]。CPNE3與ErbB2相互作用，促進腫瘤細胞遷移[11]。

圖4 CPNE1過表達細胞株下游的信號通路

而在本研究中我們發(fā)現(xiàn)CPNE1在促進腫瘤增殖過程中激活了c-MET。c-MET不僅可以促進正常細胞組織修復和再生，也可以促進腫瘤細胞增殖、存活、運動和侵襲，與腫瘤的生長、預后以及耐藥都有著緊密的聯(lián)系[12-13]。在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、頭頸癌和非小細胞肺癌中已證實，無論是否有基因擴增，c-MET過表達均提示預后不良[7]。本文首次報道了CPNE1其作用機制涉及到c-MET信號通路。CPNE1可以激活c-met從而促進細胞的增殖，引起下游相關(guān)的p-Akt、p-Erk信號的升高。

也有研究表明，CPNE1可以通過EGFR影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，我們的這一發(fā)現(xiàn)完善了CPNE1作用于腫瘤細胞的信號通路機制。CPNE1既可以激活EGFR，也可以激活 c-MET，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。而EGFR和MET之間亦存在著共激活或交叉作用[14]。另外，在有EGFR突變的非小細胞肺癌中，通過產(chǎn)生MET或AXL等旁路信號激活，可獲得EGFR-TKI的耐藥性[15]。部分EGFR-TKI治療后耐藥的原因正是由于c-MET的擴增和激活[15-16]。CPNE1與c-MET之間的作用給了我們新的探索思路。

CPNE1與c-MET的作用關(guān)系提示其可能與相關(guān)基因的靶向治療存在潛在聯(lián)系，其機制還需要我們進一步探索，更好地理解c-MET和CPNE1之間的作用機制，有助于更早的找到癌癥靶向治療新的生物標志物。