MNU誘導(dǎo)大鼠膀胱癌基底膜病變與LN的相關(guān)性

姜 濤 高海捷

膀胱癌在全球癌癥死亡率中排名13，是全球第九大最常見的癌癥[1]；作為泌尿外科最常見的惡性腫瘤之一，近十年間其發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[2]；約50%將在初次診斷后2年內(nèi)再次復(fù)發(fā)，16%～25%將在內(nèi)鏡切除術(shù)后復(fù)發(fā)[3]，嚴(yán)重影響人們的身心健康；為了更好的研究膀胱癌的生物學(xué)行為，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成為了必不可少的一部分；而動(dòng)物因?yàn)橛兄c人類相似的生理結(jié)構(gòu)和遺傳特性，對(duì)人類疾病動(dòng)物模型的研究在一定條件下往往可以實(shí)際運(yùn)用到人類。本次實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)65只SD成年雌性大鼠膀胱癌造模過(guò)程的觀察，探討其發(fā)生、發(fā)展與基底膜中LN的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)的65只SD成年雌性大鼠，平均重量(185±35)g，購(gòu)置于西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室；所有老鼠隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組50只，對(duì)照組15只；正常喂養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MNU購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,枸櫞酸緩沖液、多聚甲醛購(gòu)于灝洋生物有限公司；MNU(1 g裝)置于4 ℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)前稱取0.2 g加入10 ml(PH=6.0)的枸櫞酸溶液混合配置成20 mg/ml MNU溶液，1小時(shí)內(nèi)用完。5%的水合氯醛由陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心自制；無(wú)菌硬膜外導(dǎo)管來(lái)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)室；LN抗體來(lái)自武漢博士德公司。

1.2 方法

膀胱灌注：對(duì)實(shí)驗(yàn)組50大鼠進(jìn)行MNU溶液膀胱灌注；利用10%的水合氯醛溶液(0.3 ml/100 g)進(jìn)行腹腔注射麻醉；待大鼠麻醉后仰臥固定，用碘伏對(duì)尿道口進(jìn)行消毒，選取硬膜外導(dǎo)管鈍頭面截取5 cm對(duì)大鼠進(jìn)行導(dǎo)尿，導(dǎo)尿后予以膀胱灌注0.1 ml MNU溶液，拔出導(dǎo)管后按壓夾閉尿道。對(duì)照組同樣在水合氯醛麻醉下以0.1 ml枸櫞酸緩沖液進(jìn)行膀胱灌注。所有大鼠平均1.5～2.0小時(shí)排尿。均以含抗生素飲水作為大鼠灌注后飲水，預(yù)防感染，2天后恢復(fù)正常飲水；膀胱灌注每隔2周進(jìn)行1次，共進(jìn)行4次膀胱灌注；病理檢測(cè)：每次膀胱灌注后1周隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)組4只及對(duì)照組2只行HE病理染色觀察膀胱粘膜病變情況；免疫組織化學(xué)：取與病理檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的組織行免疫組化觀察基底膜中LN的情況；最后正常喂養(yǎng)至誘癌終點(diǎn)14周，再對(duì)剩余大鼠分別行HE以及免疫組化。

1.2.1 采集標(biāo)本 大鼠同樣在10%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，仰臥固定，腹部常規(guī)消毒后在下腹部切開1.5 cm左右，鈍行分離肌肉，切開膀胱組織觀察膀胱粘膜情況，然后取下整塊膀胱組織，浸泡于多聚甲醛溶液中；然后對(duì)切口進(jìn)行縫合，最后注射大劑量的水合氯醛處死，安置好。

1.2.2 組織病理檢測(cè) 膀胱組織常規(guī)切片脫蠟至水，水洗，吹干；蘇木精復(fù)染2 min，水洗，吹干；將實(shí)驗(yàn)片放入酒精中浸泡30 s；滴加核固紅10 s后，水洗，吹干，封片。

1.2.3 免疫組織化學(xué) 免疫組化檢測(cè)基底膜中LN蛋白的表達(dá)情況。切片常規(guī)脫蠟至水；30%H2O2蒸餾水稀釋10倍，室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶，然后水洗；將切片浸入EDTA溶液,微波爐中高火加熱至沸騰，放置5、6 min，重復(fù)加熱第二次，然后自然冷卻；滴加5%BSA封閉液,37 ℃ 30 min，甩去多余液體,不洗。滴加適當(dāng)稀釋的一抗(抗體按1∶100稀釋)，溫箱孵育2兩小時(shí)；PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG,37 ℃ 30 min；PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×3次；滴加試劑SABC,37 ℃ 30 min；PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×4次；使用DAB顯色試劑盒顯色，取1 ml蒸餾水,加試劑盒中A,B,C試劑各1滴,混勻后加至切片，室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間約5分鐘，蒸餾水洗滌；蘇木精輕度復(fù)染，封片。

1.2.4 免疫組化結(jié)果判定 正常膀胱上皮細(xì)胞基底膜LN染色，基底膜呈連續(xù)、完整的結(jié)構(gòu)，而膀胱癌細(xì)胞基底LN免疫反應(yīng)物染色呈現(xiàn)不一，呈現(xiàn)出基底膜缺損、基底膜成分LN丟失或無(wú)基底膜形態(tài)。LN判斷標(biāo)準(zhǔn)為:無(wú)著色或碎片狀為“-”，斷線狀為“+”,連續(xù)狀為“++”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0版統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，對(duì)基底膜中LN表達(dá)情況采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組50只，整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段死亡6只；實(shí)驗(yàn)大鼠病理檢測(cè)為膀胱癌的有29只，其中原位癌18只，浸潤(rùn)性癌11只,膀胱非典型增生的9只，化學(xué)性炎癥的5只，表現(xiàn)正常的1只。對(duì)照組死亡2只，其余13只病理檢測(cè)均為正常膀胱組織。本組實(shí)驗(yàn)中MNU誘導(dǎo)膀胱癌的發(fā)生率為58%；死亡率為12%；導(dǎo)致膀胱粘膜出現(xiàn)其他異常改變?yōu)?8%；正常為2%。

2.2 病理結(jié)果

第1次MNU膀胱灌注后1周，膀胱粘膜開始出現(xiàn)化學(xué)性膀胱炎表現(xiàn)；第2次MNU膀胱灌注后1周，膀胱粘膜炎癥表現(xiàn)加重并開始出現(xiàn)非典型增生；第3次MNU膀胱灌注后1周膀胱粘膜出現(xiàn)大量異型增生細(xì)胞；第4次膀胱灌注后病理檢查出現(xiàn)膀胱原位癌表現(xiàn)。誘癌終點(diǎn)14周，病理檢查為浸潤(rùn)性癌或原位癌。

2.3 基底膜動(dòng)態(tài)觀察(表1)

第1次MNU膀胱灌注后1周，LN結(jié)果顯示膀胱基底膜開始出現(xiàn)連續(xù)性斷裂現(xiàn)象；第2次膀胱灌注后1周，LN結(jié)果顯示膀胱基底膜斷裂現(xiàn)象明顯并出現(xiàn)小塊缺損；第3次膀胱灌注后1周，LN結(jié)果顯示膀胱基底膜大面積破壞，缺損；第4次膀胱灌注后1周，LN結(jié)果顯示膀胱基底膜形態(tài)完全消失，部分LN缺失；誘癌終點(diǎn)第14周，LN結(jié)果顯示無(wú)膀胱基底膜形態(tài)，視野下為散在碎片，大量LN缺失。

2.4 兩組LN積分等級(jí)表達(dá)情況

正常膀胱組織中基底膜LN染色，呈現(xiàn)完整連續(xù)，而膀胱癌細(xì)胞基底LN呈現(xiàn)出基底膜缺損、基底膜成分LN丟失或無(wú)基底膜形態(tài)；LN在基底膜中的表達(dá)在正常膀胱組織與膀胱癌之間存在差異性統(tǒng)計(jì)意義(χ2=25.37；P<0.01)，見表2；膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展與基底膜破壞密切相關(guān)，且LN的缺失是基底膜破壞導(dǎo)致膀胱癌的因素之一。

表1 兩組基膜LN積分等級(jí)表達(dá)情況/例

表2 不同組別中的LN積分等級(jí)表達(dá)情況/例

3 討論

膀胱癌作為1個(gè)罕見高復(fù)發(fā)率的惡性腫瘤，侵襲和轉(zhuǎn)移是其最主要的生物學(xué)特征，過(guò)程十分復(fù)雜，常包含黏附相關(guān)分子、細(xì)胞骨架蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、血管生成相關(guān)因子和蛋白水解酶等；因此膀胱癌診治問(wèn)題一直困擾著人們，為了更加有效的研究膀胱癌，Black等認(rèn)為在膀胱癌動(dòng)物模型必不可少[4]；MNU誘導(dǎo)大鼠膀胱癌模型發(fā)生最早是由國(guó)外學(xué)者CC Irving 在1979首次報(bào)道的[5]；隨著時(shí)代的發(fā)展和需求的不同，各異的造模方式也應(yīng)運(yùn)而生，藥物誘導(dǎo)方面還可以應(yīng)用N-丁基-N (4-羥丁基) 亞硝胺 (BBN)、硝基呋喃噻唑甲酰胺 (FANFT)；原位、異位移植膀胱癌細(xì)胞和調(diào)控特定基因誘發(fā)膀胱癌等也已十分成熟；但經(jīng)典的MNU膀胱灌注誘導(dǎo)大鼠膀胱癌動(dòng)物模型其擁有成瘤率高、簡(jiǎn)單易操作、周期短、大鼠成活率高等優(yōu)點(diǎn)為人們所接受，廣泛用于膀胱癌進(jìn)一步研究探索[6-7]，成為膀胱癌動(dòng)物模型首選。而LN是在細(xì)胞外基質(zhì)的基底層區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的大小在(400～900 kDa)糖蛋白家族；是胚胎發(fā)育中出現(xiàn)最早的細(xì)胞外基質(zhì)成分；作為一個(gè)橋梁分子，介導(dǎo)細(xì)胞同基膜結(jié)合；參與多種重要的生物學(xué)活動(dòng)，包括參與基底膜的組成、細(xì)胞的黏附、游走、增殖、分化等；隨著研究的進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)LN不僅存在于正常細(xì)胞中，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)更為異常，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增加蛋白水解酶的活性，分解并減少了LN，促進(jìn)腫瘤惡性表型的發(fā)生，是影響腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵點(diǎn)；如Oh等研究發(fā)現(xiàn)LN異常表達(dá)可能是甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)，可增加癌細(xì)胞入侵的能力，影響甲狀腺癌患者的預(yù)后[8]；Carpenter研究發(fā)現(xiàn)LN332作為肺組織的組分，其可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移期間轉(zhuǎn)運(yùn)至肺，并且有可能為抗轉(zhuǎn)移治療提供了靶標(biāo)[9]；Kiyokawa 在對(duì)肝細(xì)胞癌(HCC)早期診斷的研究中發(fā)現(xiàn)單體LN-γ2可以作為肝細(xì)胞癌的新型生物標(biāo)志物[10]；Liu 等在對(duì)肺癌的研究發(fā)現(xiàn)LN-5可能是治療肺癌患者的新的治療策略[11]，Harryman研究認(rèn)為L(zhǎng)N-β3鏈有可能是有前景的生物標(biāo)志物，也是個(gè)體化治療預(yù)防或阻止轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的合理靶點(diǎn)[12]；大量的研究成果都表明LN在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面的重要性。

在關(guān)于膀胱癌的研究中Sankiewicz等研究發(fā)現(xiàn)健康人和膀胱癌患者中LN-5的濃度明顯不同，認(rèn)為L(zhǎng)N-5有可能作為潛在的膀胱癌的標(biāo)記物[13]；Nakagawa 等研究認(rèn)為L(zhǎng)N-γ2可能是診斷非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的有希望的生物標(biāo)志物，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)尿液中的表達(dá)情況，用于診斷和提示術(shù)后復(fù)發(fā)的可能性[14]；Kang等認(rèn)為膀胱癌患者惡性程度越高，則表達(dá)更多LN332且LN332刺激膀胱癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲[15]；Chang 研究發(fā)現(xiàn)LN-Lu/BCAM的存在在人泌尿道上皮中是致癌的并且其在膀胱癌中高表達(dá)可能具有作為新的治療靶標(biāo)的潛力[16]；Pradhan等研究侵入性膀胱癌和非侵入性膀胱癌時(shí)發(fā)現(xiàn)侵襲性和惡性尿路上皮細(xì)胞周圍完全沒有LN染色，與正?；啄と旧忻黠@區(qū)別，LN的免疫組化染色可用于區(qū)分膀胱癌的侵襲程度[17]；綜上所述，LN在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展方面有著至關(guān)重要的作用，值得去深入了解。

本組實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)觀察MNU誘導(dǎo)雌性大鼠膀胱癌基底膜變化過(guò)程以及基底膜中LN的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與基底膜的破壞密切相關(guān)；隨著MNU膀胱灌注次數(shù)增加膀胱粘膜可從化學(xué)性炎癥階段，到異型增生，再到癌變；在這個(gè)過(guò)程中基底膜出現(xiàn)連續(xù)性斷裂，到缺損、丟失，最終到無(wú)基底膜形態(tài)；而且通過(guò)對(duì)基底膜中LN表達(dá)情況的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)LN的缺失是導(dǎo)致膀胱癌的原因之一。