染料木素對LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用

苗悅　都中蕊　楊葉　陳文芳

[摘要]目的探討染料木素（GEN）對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及雌激素核受體（ER）阻斷劑ICI182，780的阻斷效應(yīng)。

方法常規(guī)培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，分為對照組、LPS組、GEN+LPS組、ICI182，780+GEN+LPS組。對照組和LPS組細(xì)胞分別給予0.1g/L二甲基亞砜（DMSO）和1mg/L的LPS作用6h;GEN+LPS組細(xì)胞在加入LPS前先用GEN（10μmol/L）預(yù)保護(hù)1h;ICI182，780+GEN+LPS組先加入ICI182，780（1μmol/L）作用細(xì)胞1h，然后加入GEN預(yù)保護(hù)1h，再加入LPS共同作用6h。應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測各組腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-[STBX]1β）基因的表達(dá)。

結(jié)果與對照組比較，LPS組炎性因子TNF-α和IL-[STBX]1β基因的表達(dá)明顯上調(diào)（F=131.00、43.13，q=26.04、14.95，P<0.01）;GEN預(yù)保護(hù)能明顯降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-[STBX]1β基因表達(dá)上調(diào)（q=17.08、9.70，P<0.01），此作用可以被ER特異性阻斷劑ICI182，780所阻斷（q=10.27、5.85，P<0.01）。

結(jié)論GEN能夠抑制LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-[STBX]1β的基因表達(dá)，其抗炎機(jī)制與ER途徑的激活有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]染料木黃酮;脂多糖類;小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;炎癥;腫瘤壞死因子α;白細(xì)胞介素1β

[中圖分類號]R338.2;R916.4

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]2096-5532（2020）01-0001-04

近年來，越來越多的研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞參與了帕金森?。≒D）的發(fā)病和進(jìn)展[1]。雖然小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少，僅占成年大腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞群的10%～15%[2]，但它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的宿主防御和組織修復(fù)中起重要作用[3]。因此，如何有效地預(yù)防或抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化并保護(hù)神經(jīng)元免受損傷是研究人員目前關(guān)注的問題。研究表明，雌激素可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，其抑制作用與小膠質(zhì)細(xì)胞上的雌激素受體有關(guān)[4]。然而，長期使用雌激素可導(dǎo)致激素依賴性疾病[5]，如乳癌和子宮內(nèi)膜癌等，從而限制了雌激素的臨床應(yīng)用。植物雌激素因其具有副作用小、使用安全等特點越來越受到人們的關(guān)注。染料木素（GEN）是從豆科植物如大豆中提取的，該物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)與類固醇雌激素相似，可以激活經(jīng)典的雌激素核受體（ER）和G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（GPER）。GEN的生物學(xué)作用包括抗炎[6]、抗氧化[7]、抗癌[8]、保護(hù)骨骼[9]以及保護(hù)心血管系統(tǒng)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，GEN可以抑制炎性因子的生成，在體內(nèi)發(fā)揮抗炎保護(hù)作用。有臨床研究表明，PD病人腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，釋放的炎癥因子導(dǎo)致神經(jīng)元損害，而神經(jīng)元的損傷會進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞，從而在小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)元損傷之間形成惡性循環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[11]。GEN可對抗上述過程[12-13]。本課題組前期實驗已經(jīng)證明GEN可以通過雌激素膜受體（GPER）發(fā)揮抗炎作用[14]，因GEN還能與ER結(jié)合，為探討ER是否參與了GEN對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用，本研究觀察了ER特異性阻斷劑ICI182，780對GEN抗炎作用的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

GEN購自上海同田生物技術(shù)有限公司;脂多糖（LPS）和ICI182，780購自美國Sigma公司;BV2小膠質(zhì)細(xì)胞屬于小鼠小膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，購自北京市協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心;TRIzol試劑購自美國LifeTechnologies公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Roche公司;SYBRGreen購自美國Takara公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶或6孔板中，應(yīng)用高糖DMEM培養(yǎng)液（含100kU/L青霉素、100mg/L鏈霉素和體積分?jǐn)?shù)0.10FBS），置于含體積分?jǐn)?shù)0.05CO2的37℃無菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時進(jìn)行分組和加藥處理。將細(xì)胞分為對照組（A組）、LPS組（B組）、GEN+LPS組（C組）和ICI182，780+GEN+LPS組（D組）。對照組細(xì)胞給予0.1g/L二甲基亞砜（DMSO）處理;LPS組細(xì)胞則加入LPS（1mg/L）作用6h;GEN+LPS組細(xì)胞加LPS前先用GEN（10μmol/L）預(yù)保護(hù)1h;ICI182，780+GEN+LPS組細(xì)胞先加入ICI182，780（1μmol/L）作用1h，然后加入GEN（10μmol/L）預(yù)保護(hù)1h，再加入LPS（1mg/L）共同作用6h。

1.3實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-[STBX]1β）mRNA的表達(dá)

應(yīng)用TRIzol裂解細(xì)胞，提取總RNA。加入總RNA1μg、5×gDNAEraserBuffer2μL、gDNA1μL，補充DEPC水使總體積達(dá)10μL，輕輕混勻、離心。在42℃下變性2min，立即置于冰上冷卻。然后將RTPrimerMix1μL、5×PrimeScriptBuf-

fer2（forRealTime）4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1μL、RNaseFreeddH2O4μL加入第一步反應(yīng)體系中至總體積20μL，混勻、離心。在37℃下反應(yīng)15min，然后升溫至85℃，作用5s使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，4℃冷卻。采用SYBRGreen染料法定量檢測TNF-α和IL-[STBX]1β與GAPDH的基因表達(dá)。PCR擴(kuò)增引物及其序列見表1。采用2-△△CT法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果以[AKx-D]±s形式表示，應(yīng)用GraphPadPrism5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-WayANOVA）并繼以Tukey法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05則表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

與對照組相比，LPS組炎性因子TNF-α和IL-[STBX]1β的基因表達(dá)均明顯上調(diào)（F=131.00、43.13，q=26.04、14.95，P<0.01）;GEN+LPS組TNF-α和IL-[STBX]1β的基因表達(dá)較LPS組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q=17.08、9.70，P<0.01）;GEN的抗炎作用可以被ER特異性拮抗劑ICI182，780所阻斷，ICI182，780+GEN+LPS組與GEN+LPS組細(xì)胞TNF-α和IL-[STBX]1β基因表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（q=10.27、5.85，P<0.01）。見表2。

3討論

PD是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默?。ˋD）的一種神經(jīng)退行性疾病[15]，其病理學(xué)特征是黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性退化和缺失[16]。PD的確切病因目前尚不明確，但已知與環(huán)境、遺傳和免疫因素等有關(guān)。1988年，有研究者認(rèn)為炎癥可能是PD的第一致病機(jī)制[17]。MCGEER等[18]研究結(jié)果顯示，促炎細(xì)胞因子合成增加可以激活PD病人紋狀體的小膠質(zhì)細(xì)胞。近年來，越來越多的研究表明，神經(jīng)炎癥在PD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[19-22]。神經(jīng)炎癥的特征包括小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增多以及許多炎癥遞質(zhì)如細(xì)胞因子、趨化因子、前列腺素、補體級聯(lián)蛋白、活性氧和活性氮等物質(zhì)的釋放[23-25]。這些因素可以破壞血-腦脊液屏障并使免疫細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此，越來越多的研究者開始關(guān)注如何有效降低神經(jīng)炎癥，為神經(jīng)退行性疾病的治療提供作用靶點。

GEN是一種從豆科植物中提取的脂溶性黃酮類化合物，作為一種能有效滲透血-腦脊液屏障的植物雌激素受到了廣泛關(guān)注[26-28]。以往的研究結(jié)果表明，GEN能與ER結(jié)合誘導(dǎo)雌激素調(diào)控的靶基因表達(dá)[29]。近年來，人們認(rèn)為GEN在體內(nèi)和體外都具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用[30-33]。本課題組前期研究結(jié)果表明，GEN對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡具有保護(hù)作用[34]。GEN能對抗6-羥基多巴胺（6-OHDA）對SK-N-SH細(xì)胞的神經(jīng)毒性[35]。近年來的研究顯示，GEN可通過Toll樣受體4（TLR4）和核因子κB（NF-κB）信號通路拮抗β-淀粉樣肽或LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷[12-13]。本課題組前期研究表明，GEN對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)有劑量依賴性的抑制作用，10μmol/L的GEN抗炎作用顯著，且其抗炎作用可以被GPER特異性阻斷劑G15所阻斷[14]。為進(jìn)一步探討經(jīng)典核受體ER是否參與了GEN的抗炎抑制作用，本實驗觀察了ER的特異性阻斷劑ICI182，780對GEN抗炎作用的影響，結(jié)果顯示，應(yīng)用阻斷劑后，GEN對炎癥因子TNF-α和IL-[STBX]1β基因表達(dá)的抑制作用明顯降低，表明ER也參與了GEN的抗炎作用。

綜上所述，GEN能夠抑制LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-[STBX]1β的基因表達(dá)，其抗炎機(jī)制與ER信號途徑的激活有關(guān)。

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（本文編輯 馬偉平）