聯(lián)合VEGF-165和PDGF-BB促進骨髓間充質干細胞血管化的體內研究

畢翔宇，孫 安，何惠宇

面對腫瘤、頜骨囊腫及外傷等造成的大范圍骨組織缺損，自體骨移植由于骨量不足不能完成對大塊組織缺損的修復[1]。目前人工合成的組織工程骨雖然不受骨量不足的限制，但許多研究均發(fā)現(xiàn)由于缺乏有效的血液供應，來自組織液的氧氣和營養(yǎng)物質只能滿足人工骨支架外層100～200 μm范圍內的細胞代謝，而位于支架中心部位的細胞則由于缺乏氧氣和營養(yǎng)供給出現(xiàn)壞死，不能形成新骨[2-3]。近年來血管化在組織工程研究中的地位逐漸上升，血管化的組織工程骨能夠為缺損區(qū)帶來充足的氧氣、營養(yǎng)物質、干細胞和相關信號分子[3]。因此，利用血管化的方法使移植部位形成新生血管并長入人工骨支架內部，使支架表層及內部均能獲得充足的血液供給，從而提高組織工程骨的成活率，將有助于大范圍骨缺損的修復。

血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是生理性血管生成過程中重要的調控因子[3]，在血管生成早期即可發(fā)揮作用并持續(xù)到血管生成的各個時期[4]，能夠提高組織的血流量[5]。VEGF能與內皮細胞的表面受體特異性結合，從而促進血管內皮細胞增殖并聚集形成血管管腔結構[3-4]。在血管形成過程中血小板源性生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)與血管平滑肌細胞和周細胞表面的受體結合能夠促進血管平滑肌細胞和周細胞聚集并包裹血管內皮細胞，維持血管結構的完整和穩(wěn)定[3]，敲除PDGF及其受體的基因會導致血管平滑肌細胞和周細胞的缺失[5-7]。因此聯(lián)合應用VEGF與PDGF將有望促進新血管的形成，同時有利于形成完整而穩(wěn)定的血管。

骨髓間充質干細胞(bone marrow steam cell,BMSCs)是組織工程研究中常用的種子細胞，具有多向分化潛能，能夠向骨、軟骨、神經、脂肪及血管等方向分化[8]。由日本學者Elloumi-Hannachi等[9]發(fā)明的細胞膜片技術無需胰酶消化，完整地保留了細胞間連接及細胞自身分泌的細胞間基質。細胞間連接的保留有利于細胞間的信號傳導和細胞的增殖和分化。細胞間基質能儲存生長因子并緩慢釋放到周圍環(huán)境當中，對生長因子起到了一定程度的緩釋作用。因此本實驗以細胞膜片作為VEGF與PDGF的載體來研究其對血管化的作用。

本課題組前期體外實驗已證實VEGF-165和PDGF-BB兩種細胞因子促進骨髓干細胞增殖及成血管分化的最佳濃度均為80 ng/mL。本實驗以此為前提聯(lián)合應用VEGF-165及PDGF-BB兩種生長因子作用于大鼠骨髓干細胞膜片并植入大鼠體內，通過比較單獨與聯(lián)合應用VEGF-165與PDGF-BB對成血管相關基因表達及新生血管數量、管腔面積和管腔形態(tài)的影響來驗證聯(lián)合VEGF-165與PDGF-BB對血管生成是否具有協(xié)同作用，為其在骨組織工程血管化的應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

250～300 g SD雄性大鼠及40～50 g SD大鼠，雌雄不限，均購自新疆醫(yī)科大學實驗室與動物管理處動物實驗中心。α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，L谷氨酰胺(Hyclone，美國)，胎牛血清(四季青，中國)，RT-PCR儀(BIO-RAD，美國)，PCR Kit(QIAGEN，德國)，顯微鏡、切片機、脫水機、包埋機(徠卡，德國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 40～50 g SD大鼠作為骨髓干細胞供體，250～300 g SD大鼠用于構建動物模型。實驗分為對照組(僅加入細胞膜片不加入生長因子)、單純VEGF組(V組)、單純PDGF組(P組)和VEGF+PDGF組(V+P組)。分別于2周和4周兩個時間點回收標本。

1.2.2 大鼠骨髓干細胞的分離培養(yǎng) 將4周齡SD大鼠脫頸處死，浸泡于75%乙醇中消毒5 min。用眼科剪分離四肢及皮膚。用手術刀片分離肌肉，僅保留四肢長骨。將取下的長骨浸泡于裝有PBS溶液的15 mL離心管中，并暫時于冰盒中存放。將取下的四肢長骨在無菌操作臺下用眼科剪剪斷長骨的干骺端，然后用注射器反復沖洗骨髓直至骨組織表面發(fā)白。將所得細胞懸液在1 000 r/min條件下離心5 min，棄上清，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸沉淀。將細胞懸液接種到25 cm2的培養(yǎng)皿中。每3天換一次液，細胞長至80%～90%時傳代。

1.2.3 細胞膜片的構建 將第三代骨髓間充質干細胞以3×105/孔接種到六孔板中，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基。待細胞長滿100%時更換含10%胎牛血清、1%青鏈霉素和50 μg/mL抗壞血酸的α-MEM培養(yǎng)基，每2天換一次液連續(xù)培養(yǎng)6 d，第7天時更換不含抗生素的培養(yǎng)基直至成膜。

1.2.4 構建動物實驗模型 根據本課題組前期實驗結果證實的80 ng/mL VEGF-165 和80 ng/mL PDGF-BB為促骨髓干細胞成血管分化的最佳濃度。將生長因子以該最適濃度加入細胞膜片培養(yǎng)24 h以備回植。用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g腹腔注射對大鼠進行麻醉。麻醉后于腹部正中做一2 cm切口，鈍性分離皮下組織形成一盲袋以供細胞膜片植入。實驗組分別植入含有80 ng/mL VEGF-165、80 ng/mL PDGF-BB和同時含80 ng/mL VEGF-165和80 ng/mL PDGF-BB的細胞膜片。對照組僅回植膜片。膜片植入后用3-0縫線縫合皮膚，見圖1。

A：膜片植入前于六孔板中；B：膜片植入后縫合創(chuàng)口；C：體內標本；D：標本取出后

圖1膜片植入前及標本取出后圖片

Fig.1Cell sheet and tissue sample

1.2.5 蘇木素-伊紅染色 分別于造膜后2周和4周取出標本，見圖1，分別經4%多聚甲醛固定48 h后梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度切片。將切片置于60 ℃過夜后行蘇木素-伊紅染色。最后中性樹膠封片，顯微鏡下放大100倍拍照。

1.2.6 RNA提取、逆轉錄及RT-PCR 將回收的組織塊于液氮中速凍后用研磨儀研磨成碎絮狀。研磨后的組織用Trizol法提取總RNA，使用takara逆轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。用RT-PCR法檢測成血管相關因子低氧誘導因子-1-α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1-α)、血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、類胰島素生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)的基因表達，此過程重復3次。利用NCBI查找目的基因，通過Primer 5.0軟件進行引物設計。引物序列見表1。

1.2.7 新生血管測量 從每組中隨機選取5～8張切片，將切片在光鏡下放大100倍拍照，根據完整的內皮細胞來確定血管的范圍，利用Image Pro軟件對每張切片中的所有血管的管腔面積進行測量，同時統(tǒng)計出每張照片的血管數量。

1.3 統(tǒng)計學分析

表1目的基因的引物序列

Tab.1Primer of target genes

基因引物序列HIF-1-α5′-CCGCCACCACCACTGATGAATC-3′(F)5′-CCGACTGTGAGTACCACTGTATGC-3′(R)Ang-15′-TTCTTCGCTGCCATTCTGACTCAC-3′(F)5′-GTTGTACTGCTCTGTCGCACTCTC-3′(R)HGF5′-CAGTCAGCACCATCAAGGCAAGG-3′(F)5′-CCACGACCAGGAACAATGACACC-3′(R)IGF-15′-CTGGTGGACGCTCTTCAGTTCG-3′(F)5′-ACAGTACATCTCCAGCCTCCTCAG-3′(R)

2 結 果

2.1 成血管相關因子表達量

術后2周、4周各組Ang-1、HIF-1-α、HGF和IGF-1基因的表達見表2。術后2周及4周V+P組的基因表達量最高，其次為P組，對照組表達量最低，4組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組的基因相對表達量見表 2。

表2 術后2周、4周成血管因子表達量

2.2 血管數量、面積計算結果

術后2周和4周(表3)可見V組血管的管腔面積明顯高于對照組(P<0.05)。P組和V+P組的管腔面積與對照組相比差異不大。術后2周和4周均可見V+P組血管數量高于另外三組，約為另外三組的2～3倍(P<0.05)。2周和4周相比，4周各組血管數量均高于2周(P<0.05)。

2.3 HE染色結果

鏡下(圖2)可見V組血管管腔形態(tài)不規(guī)則，管腔面積與對照組相比擴張明顯。V+P組血管管腔形態(tài)及面積與對照組相似。P組管腔面積與對照組相似，但管腔形態(tài)不同于對照組的卵圓形結構。

表3 術后2周、4周各組血管面積及數量

A：術后2周V組；B：術后2周P組；C：術后2周V+P組；D：術后2周對照組；E：術后4周V組；F：術后4周P組；G：術后4周V+P組；H：術后4周對照組

圖2術后2周和4周HE染色結果

Fig.2HE staining2and4weeks after graft

2.4 細胞膜片大體形態(tài)

BNSCs接種于六孔板后連續(xù)培養(yǎng)14～20 d可見培養(yǎng)皿底部有白色半透明膜樣物質即為所形成的膜片。部分培養(yǎng)皿中可見膜片邊緣卷起，與培養(yǎng)皿透明底部形成對比。膜片可以用鑷子提起，有一定張力，完全提起后膜片聚縮成一團(圖3)。

A：用鑷子提起膜片；B：用鑷子提起后膜片縮聚成一團；C：去掉培養(yǎng)基后可見膜片呈乳白色半透明狀；D：膜片附著在培養(yǎng)皿底部部分邊緣卷起

圖3骨髓干細胞膜片

Fig.3Bone marrow steam cell sheet

3 討 論

血管化作為組織工程骨移植的基礎，近年來與其相關的研究取得了突出進展，其中生長因子在血管化的過程中扮演著十分重要的角色。本實驗以BMSCs為種子細胞研究血管化中最重要的生長因子VEGF-165和PDGF-BB是否對血管化具有協(xié)同作用，并比較聯(lián)合兩種生長因子與單獨使用一種生長因子對成血管的影響。

VEGF是病理性及生理性血管形成中的重要生長因子[10]。其受體包括VEGFR-1(flt1)、VEGFR-2(flk1)、VEGFR-3(flt4)，其中血管內皮細胞(ECs)表面存在VEGFR-2。VEGF-165是VEGF家族促血管生成能力最強的生長因子，與VEGFR-2結合后能促進血管內皮細胞的有絲分裂，同時促進血管內皮細胞向受損的血管部位遷移并聚集形成血管管腔結構[11-12]。但是血管的生成不僅依賴于血管內皮細胞的增殖和聚集，同時也需要周細胞及平滑肌細胞從外側包裹血管內皮細胞從而形成完整而穩(wěn)定的血管結構[13]。PDGF是來源于血小板的一種雙鏈二聚體可溶性糖蛋白，其結構包含5種同分異構體分別是PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD和PDGF-AB，與其相對應的受體有PDGFR-αα、PDGFR-ββ和PDGFR-αβ[14-15]。其中PDGF-BB可以與這3種受體結合，是PDGF家族中活性最強的細胞因子[16]。當PDGF與其受體結合時會激活包括Ras-ERK、c-Src和Rap1-Rac在內的信號通路[17]。通過激活上述信號通路，PDGF能夠使血管平滑肌細胞與周細胞增殖并聚集到ECs周圍[18-19]。PDGF或PDGFR的基因敲除將導致新生成的ECs管腔由于缺乏周細胞及平滑肌細胞的覆蓋而不能形成完整的血管管腔結構[20-21]。本實驗中V組的血管管腔結構較對照組擴大明顯，且鏡下可見其外形不規(guī)則，而V+P組的管腔結構與對照組相似為卵圓形，且血管管腔面積也與對照組相似，推測由于PDGF的加入促進了周細胞及平滑肌細胞對血管內皮細胞的包裹，使新形成的血管具備完整的管腔結構，而V組由于缺乏PDGF-BB同時VEGF-165不具備募集周細胞及平滑肌細胞的能力導致新生血管缺乏周細胞及平滑肌細胞層，不能形成正常的血管。說明VEGF-165與PDGF-BB聯(lián)合作用的成血管效果優(yōu)于單獨使用VEGF-165一種生長因子。單位面積內的血管數量能夠反映出組織的血供，血管數量越多說明血供越好。本實驗對血管數量的統(tǒng)計結果表明術后2周、4周V+P組血管數量是其他三組的2～3倍，而V組和P組未表現(xiàn)出明顯的血管增多，說明聯(lián)合使用VEGF-165與PDGF-BB能更加促進新血管的形成，有利于提高組織的血液灌注。實驗中隨著時間的推移，4周各組血管數量要高于2周，推測術后4周時血管的增長并沒有達到平臺期，因此還需要長期的效果觀察。

血管形成過程中除了有VEGF和PDGF發(fā)揮作用外還有包括Ang-1、Hif-1-α、HGF和IGF-1等多種生長因子參與，這些生長因子在血管形成過程中表達上調[20-22]。為從基因層面驗證聯(lián)合應用VEGF-165與PDGF-BB對血管化的促進作用優(yōu)于單獨使用VEGF-165或PDGF-BB一種生長因子的效果，本實驗通過PT-PCR法檢測Ang-1、Hif-1-α、HGF和IGF-1的基因表達。結果表明，術后2周及4周V+P組較V組及P組能更顯著地上調Ang-1、Hif-1-α、HGF和IGF-1的基因表達(P<0.05)。說明了聯(lián)合應用VEGF-165與PDGF-BB對新血管生成的效果優(yōu)于單一使用一種生長因子，起到了協(xié)同促進作用。

綜上所述，本實驗證明了VEGF-165與PDGF-BB在促進新血管生成方面起到了協(xié)同作用。與單獨使用一種生長因子相比，聯(lián)合VEGF-165與PDGF-BB能顯著增加新生血管的數量，并有利于維持完整的血管結構，對其進行良好的應用將對組織工程骨的血管化及組織工程骨移植修復大范圍骨缺損起到積極作用。本實驗的不足之處在于，生長因子的半衰期較短，不能長期在體內維持其有效濃度，因而缺乏長期的效果觀察，進一步研究希望能延長生長因子的作用時間。同時VEGF-165與PDGF-BB協(xié)同作用的機制仍有待進一步探索。