青皮對主要致齲細(xì)菌生長的影響及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析其防齲機制

吳澤鈺，薛 瑞，袁曦玉，從兆霞，趙 今

齲病是最常見的口腔疾病，是以細(xì)菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的疾病[1]。中藥中的植物藥被認(rèn)為是一類有效防治齲病的藥物[2]。植物藥以粗提取物的形式治療各種疾病，被證實具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用[2]，植物藥制劑已經(jīng)在齲病和牙髓疾病的治療中廣泛應(yīng)用[2-3]。青皮 (Citrusreticulate) 為蕓香科植物橘(CitrusreticulateBlanco)的干燥幼果或未成熟果實的果皮；味苦、辛, 性溫；歸肝、膽、胃經(jīng)；具有疏散退熱、舒肝解郁等作用[4]。青皮主要成分為多種氨基酸、黃酮類化合物等,柚皮素和柚皮苷為其主要防齲抑菌的有效活性成分。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology) 是結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析等技術(shù)，基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)分析軟件計算，系統(tǒng)、整體地揭示疾病-疾病、疾病-靶點、靶點-藥物之間的關(guān)聯(lián)[5]。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從整體性的角度對青皮的防齲作用機制進(jìn)行探討，并使用青皮粗提取物對主要致齲細(xì)菌的生長產(chǎn)生影響，為進(jìn)一步研究青皮臨床應(yīng)用價值提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 體外抑菌試驗

1.1.1 藥材提取 購買干燥青皮藥材(購自新疆參茸中維藥飲片有限公司)，粉碎，過60目篩。稱取500 g青皮粉末浸泡于95%乙醇中浸提24 h，重復(fù)浸提3次，料液比1∶10，合并3次浸取液。將浸取液抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器40 ℃下減壓濃縮至無乙醇餾出為止, 在低溫冷凍干燥放置冰箱4 ℃以下備用。

1.1.2 菌株及培養(yǎng)基 變形鏈球菌(S.mutansUA159)、血鏈球菌(S.sanguisATCC10556)、遠(yuǎn)緣鏈球菌(S.sobrinusATCC6715)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilusATCC4356)、黏性放線菌(A.viscosusATCC19246)、內(nèi)氏放線菌(A.naeslundiiATCC12104)以上菌株均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)。腦-心浸液培養(yǎng)基(BHI)：稱量3.7 g BHI培養(yǎng)基，加100 mL蒸餾水溶解，121 ℃ 15 min高壓滅菌，調(diào)整pH=7.0±0.2。嗜酸乳桿菌用乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MRS)培養(yǎng)。

1.1.3 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)及最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)的測定 青皮提取物按二倍稀釋法溶于含1%葡萄糖BHI、MRS液體培養(yǎng)基中，最終濃度8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 g/L(DMSO的最終濃度為1%，無殺菌作用)。分光光度計調(diào)整菌懸液密度至1×107cfu/mL(OD630=0.2)備用，將菌懸液與藥液按照1∶1(V∶V)比例，各100 μL接種于96孔板中。用震蕩l min后，變形鏈球菌、血鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌和內(nèi)氏放線菌置于厭氧條件(80%N2，20%CO2)，黏放線菌和嗜酸乳桿菌置于5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h。ΔOD≤0.05的最低濃度為MIC。選擇>MIC濃度的各孔，取20 μL涂布于BHI、MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落數(shù)少于5～6個的最低濃度為MBC。重復(fù)3次。

1.2 青皮化學(xué)成分篩選及作用基因獲取

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索青皮的化學(xué)成分，查閱并整理化學(xué)成分及作用靶點。利用PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)和ChemBL(https://www.ebi.ac.uk)確定青皮化學(xué)成分三維結(jié)構(gòu)，建立青皮化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫。將基因名轉(zhuǎn)換為UniProt數(shù)據(jù)庫中的Gene Symbol。

1.3 齲病靶點基因的篩選

通過在Gene Cards (https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/search)中輸入關(guān)鍵詞dental caries、caries等搜索相關(guān)基因，與上述青皮化學(xué)成分的藥物作用靶點進(jìn)行匹配，得到青皮化學(xué)成分防齲的潛在作用靶點。

1.4 成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

為了闡明青皮化學(xué)成分防齲機制，構(gòu)建了化合物-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測成分與靶點對應(yīng)關(guān)系。將青皮化學(xué)成分、作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，然后利用 Network Analyzer工具計算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括度值(degree)、拓?fù)湎禂?shù)(topological coefficient)[6]。采用網(wǎng)絡(luò)分析方法，確定關(guān)鍵節(jié)點，探討青皮化學(xué)成分的主要作用靶點及其作用機制。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)數(shù)據(jù)

利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫[7](https://string-db.org)提供預(yù)測靶點蛋白之間的作用網(wǎng)絡(luò)。物種限于“Homo sapiens”，置信度得分>0.4。選擇連接前10個的靶基因作為青皮防齲過程的中心基因。

1.6 基因本體(gene ontology, GO) 富集分析

生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(DAVID, https://david.ncifcrf.gov)為大規(guī)模基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，找出顯著富集的生物學(xué)注釋[8]。使用DAVID對靶點進(jìn)行GO富集分析[9]，用FDR<0.05對P值作檢驗校正，最終閾值P<0.01，篩選有顯著性差異的生物過程，利用R軟件繪圖。

1.7 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析

使用KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn)[10]對靶點進(jìn)行富集分析。輸入物種為“Homo Sapiens”，輸入靶點，進(jìn)行KEGG[11]信號通路富集分析以及相關(guān)的通路圖，并利用R軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 青皮提取物對6種主要致齲菌MIC、MBC結(jié)果

實驗結(jié)果表明，青皮提取物對6種主要致齲菌均存在抑制作用，青皮提取物濃度分別為1.0, 0.5, 1.0, 2.0, 2.0, 2.0 g/L的S.mutans,S.sanguis,S.sobrinus,A.viscosus,A.naeslundiiandL.acidophilus菌液明顯澄清，酶標(biāo)儀測ΔOD<0.05。結(jié)果詳見表1。

表1 青皮提取物對6種主要致齲菌MIC、MBC的實驗結(jié)果Tab.1 MIC and MBC values of Citrus reticulate extract to the six main cariogenic bacteria g/L

2.2 青皮化學(xué)成分的篩選

TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得青皮化學(xué)成分18個,根據(jù)青皮各成分的含量、生物利用度(OB)、類藥性(DL)結(jié)合本實驗室的研究篩選出潛在防齲作用的化學(xué)成分12個, 詳見表2。

2.3 青皮作用于齲病相關(guān)靶點

青皮的12個化學(xué)成分在TCMSP、Drugbank數(shù)據(jù)庫中獲得靶點232個, 去重后92個。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索靶點Gene symbol。通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫得到1 171個齲病相關(guān)基因, 與青皮作用靶點進(jìn)行比對取交集, 篩選出28個可能與青皮防齲相關(guān)的作用靶點, 詳見圖1，表3。

圖1 Venn圖Fig.1 Venn diagram

表2 用于網(wǎng)絡(luò)藥理分析的青皮的化學(xué)成分Tab.2 Chemical components of Citrus reticulate for network pharmacology analysis

表3 可能與青皮預(yù)防齲病相關(guān)的靶點Tab.3 Targets related to the prevention of caries

2.4 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

運用Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。圖中共42個節(jié)點(12個成分，28個靶點)和1 722條邊。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析顯示，化合物的平均度數(shù)為5.917，說明青皮防齲有多靶點屬性，其中度數(shù)較大(度數(shù)>10)的化合物為柚皮素、川陳皮素?；衔锿?fù)鋵W(xué)參數(shù)見表2。同時，許多靶點與多種成分相關(guān)，這可能表明青皮發(fā)揮藥效過程中不同化合物具有協(xié)同作用。

圖2 青皮化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Citrus reticulate chemical components-targets network diagram

2.5 蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

STRING獲取28個靶點的PPI關(guān)系。選擇組合得分>0.4，PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)有28個節(jié)點和156個邊緣(圖3A)。選擇連接性最高的10個靶基因作為防齲的中心基因(圖3B)， 腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、 半胱天冬酶-3(caspase 3，CASP3)、 過氧化氫酶(catalase，CAT)、 絲裂原激活的蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)等。

A：每個節(jié)點代表相關(guān)靶點，邊緣越多，關(guān)聯(lián)越強；B：PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因邊緣數(shù)排序

圖3青皮化學(xué)成分預(yù)防齲病靶蛋白-蛋白相互作用

Fig.3Citrusreticulatechemical components prevent cariesTargets protein-protein interaction

2.6 GO富集分析

David數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，參數(shù)設(shè)置P<0. 01，得到74個注釋信息，分為：①生物過程(biological Process，BP)，獲得52條結(jié)果，主要涉及對過氧化氫的反應(yīng)、對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)等方面;②分子功能(molecular function，MF)，獲得11條結(jié)果，主要涉及蛋白質(zhì)同源二聚化活性、蛋白結(jié)合、蛋白酶結(jié)合等方面;③細(xì)胞組分(cellular component，CC)，獲得11條結(jié)果，線粒體、細(xì)胞外泌體、細(xì)胞質(zhì)等方面，見表4，圖4。

2.7 KEGG通路富集分析

利用KOBAS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 通路富集分析，P<0.01，F(xiàn)DR校正后的Q<0.01共獲得110條結(jié)果。前20條通路，包括了4條信號通路(AGE-RAGE、TNF、NF-κB、HIF-1和癌癥通路)，6條生物系統(tǒng)相關(guān)通路(內(nèi)分泌抵抗，細(xì)胞凋亡，5-羥色胺能突觸等) 和10條疾病通路(乙型肝炎，肌萎縮側(cè)索硬化癥，結(jié)直腸癌等)。見表5，圖5。

表4 青皮對相應(yīng)基因GO富集分析結(jié)果(各前5條)Tab.4 The results of Citrus reticulate anti-caries corresponding genes GO enrichment analysis (Top 5)

表5 青皮對相應(yīng)基因KEGG富集分析(前10條)Tab.5 The results of Citrus reticulate anti-caries corresponding genes KEGG enrichment (Top 10)

圖4 潛在靶點生物學(xué)過程的GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential targets biological processes

圖5 潛在靶點生物學(xué)過程的KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of potential targets biological processes

3 討 論

植物藥衍生的次級代謝產(chǎn)物，包括不同類型的黃酮類物質(zhì)、糖苷、生物堿等，大多是潛在的天然抑菌物質(zhì)[12]。利用植物藥防治齲病是目前研究的熱點。本實驗結(jié)果表明，青皮提取物能夠有效抑制主要致齲菌的生長，對鏈球菌表現(xiàn)出較強的抑制作用，具有一定的殺菌作用。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，青皮提取物對多種細(xì)菌的生長具有抑制作用，陳青等[13]研究青皮揮發(fā)油對金葡菌等有抑菌作用，MIC在0.31～1.25 g/L；Yue等[14]研究發(fā)現(xiàn)柚皮素對變形鏈球菌的MIC在100～200 μg/mL,且減少生物膜形成，都與本研究結(jié)果一致。青皮中發(fā)揮抑菌作用的成分主要為柚皮素、柚皮苷、橙花醛等。于倩等[15]研究表明伊犁黑蜂蜂膠對主要致齲菌的MIC為4、2、8、2、1 g/L，李夢琪等[16]研究發(fā)現(xiàn)紫地榆對致齲菌的MIC為0.5～4.0 g/L。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)青皮提取物對致齲菌的MIC濃度低于蜂膠及紫地榆提取物，提示青皮可能是效果更佳的潛在防齲藥物。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法整體性、系統(tǒng)性的特點與中醫(yī)藥整體辨證原則不謀而合[17]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，構(gòu)建“青皮-成分-靶標(biāo)-齲病”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)分析青皮化學(xué)成分多途徑防治齲病的潛在機制。最終獲得12個成分，28個靶點，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示柚皮素、甜橙黃酮、萜基烯等匹配多靶點，是青皮防齲關(guān)鍵成分。靶點中TNF、CASP3、CAT等處于網(wǎng)絡(luò)中心位置，可能是青皮防齲調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的潛在調(diào)節(jié)因子。研究證明川陳皮素、柚皮素能抑制TNF、 基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)的表達(dá)[18-19]。齲病發(fā)生時，細(xì)菌刺激牙髓單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞系統(tǒng)等產(chǎn)生TNF，激活免疫系統(tǒng)參與清除感染[20]。MMPs 家族是重要的生物活性劑，參與了病理過程中細(xì)胞外基質(zhì)的崩解，能夠調(diào)節(jié)牙本質(zhì)修復(fù)的潛能[21]。

將28個靶點進(jìn)行GO富集分析，青皮化學(xué)成分主要涉及蛋白結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、對過氧化氫的反應(yīng)等生物過程，涉及細(xì)胞器、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組分，是一個復(fù)雜的調(diào)控過程。KEGG富集分析獲得110條結(jié)果，青皮防齲的潛在信號通路主要為年齡-糖基化終產(chǎn)物受體蛋白信號通路(age-receptor for advanced glycation endproducts signaling pathway，AGE-RAGE通路)、TNF通路、NF-κB通路(核因子-κB信號通路，nuclear factor -kappa B signaling pathway)等。其中AGE-RAGE信號通路能夠激活多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如TNF、NF-κB信號通路、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄途徑等[22]，NF-κB活化又可上調(diào)RAGE。AGE-RAGE激活NF-κB或其他途徑釋放與齲病相關(guān)的細(xì)胞因子，如TNF、MMP、 前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS)等[23]，能夠促進(jìn)氧化應(yīng)激，降低抗氧化酶，降低糖的利用，抑制細(xì)菌定植于牙面。

本研究既探討青皮提取物對主要致齲菌生長抑制作用，又應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對青皮潛在防齲的成分、作用靶點和機制進(jìn)行了探索性研究。由于數(shù)據(jù)庫信息的不全面，未考慮不同化學(xué)成之間的協(xié)同作用等影響，網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的結(jié)果具有一定的片面性和局限性。但是，初步驗證了青皮能有效抑制主要致齲菌的生長，以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)也顯示出青皮防治齲病的藥理活性及作用機制，為將來進(jìn)一步深入探討防齲機制的研究提供了實驗和理論依據(jù)。