蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)研究

劉奕飛 李明宇

【摘?要】蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是各種生物、各種復(fù)雜功能和各種生物大分子的組成成分。蛋白質(zhì)是生物科學(xué)的重要研究對(duì)象，如何分離純化蛋白質(zhì)是生命科學(xué)研究的重點(diǎn)之一。以前，沒(méi)有辦法從復(fù)雜的混合物中提取蛋白質(zhì)。然而，隨著科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行和發(fā)展，對(duì)于每一種蛋白質(zhì)，都可以選擇分離的方法來(lái)生產(chǎn)高純度的產(chǎn)品，其基本手段也很普遍。本文綜述了現(xiàn)有的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r并以某些蛋白提取為例進(jìn)行舉例分析提出了各項(xiàng)技術(shù)分析結(jié)果，總結(jié)了現(xiàn)有蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r并以蛋白提取物進(jìn)行舉例分析，為以后研究提純蛋白質(zhì)提供參考方法。

【關(guān)鍵詞】蛋白質(zhì);純化方法;分離技術(shù)

蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分和生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。很明顯，要從復(fù)雜的體系中提取蛋白質(zhì)，同時(shí)防止其組成、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)的變化以及生物活性的喪失是相當(dāng)困難的。目前，蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的發(fā)展趨向于更加細(xì)節(jié)化、多樣化技術(shù)的綜合使用，但這些方法的基本原理不變，都是以蛋白質(zhì)的性質(zhì)作為參考依據(jù)。本文主要針對(duì)近年來(lái)動(dòng)物蛋白純化方法的應(yīng)用做了一個(gè)綜述，并以以往的具體實(shí)驗(yàn)作了參考，詳細(xì)記錄了所用的方法，但要了解的是，在具體的實(shí)際工作中應(yīng)依據(jù)不同的要求和實(shí)驗(yàn)條件下操作，主要為以后工作者的研究提供參考方法。

1蛋白質(zhì)的分離純化提取處理方式

1.1動(dòng)物組織的細(xì)胞破碎

實(shí)驗(yàn)前我們的材料往往是動(dòng)物的組織，所以第一步是破壞動(dòng)物組織的細(xì)胞，除去大塊的組織塊，主要的方法是物理、化學(xué)和生物化學(xué)的方法。物理方法分為機(jī)械方法和非機(jī)械方法。機(jī)械方法最常用的是研磨法和勻漿法，主要用機(jī)械力粉碎組織細(xì)胞。非機(jī)械方法主要是通過(guò)各種物理要素粉碎組織細(xì)胞，有凍結(jié)熔化法、超聲波法等。廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的是超聲波破碎技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，節(jié)約液體材料。但是，由超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)可以使某些敏感活性物質(zhì)變性以及失活，所以處理一些超聲波敏感蛋白酶時(shí)應(yīng)慎重使用。

1.2動(dòng)物組織中蛋白質(zhì)的溶劑提取

大多數(shù)動(dòng)物蛋白溶于稀鹽、酸、堿液或水中，但也有一些和脂肪結(jié)合的脂肪蛋白易溶于有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮等。通常用含鹽的碳?xì)浠衔锼芤?，?duì)蛋白質(zhì)具有高且穩(wěn)定的水溶性，例如Nacl為溶液，它有利于動(dòng)物蛋白的溶解，并且，在鹽和蛋白質(zhì)的結(jié)合中，提供了對(duì)不硬化特性的保護(hù)。堿性蛋白質(zhì)通?？梢杂盟嵝匀芤哼M(jìn)行提取，酸性蛋白則相反。對(duì)陳思聰[3]等人在提取鰱魚中魚肉蛋白質(zhì)時(shí)，因?yàn)轹桇~中魚肉蛋白屬于堿性蛋白，所以用偏酸性溶液進(jìn)行提取，產(chǎn)率達(dá)90%左右。

1.2.1水溶液提取法

蛋白質(zhì)依賴于在溶液中的溶解度，如Na2PO4-NaOH提取馬尾松毛蟲幼蟲的蛋白，提取時(shí)注意需要攪拌均勻，使蛋白質(zhì)充分溶解，從利于蛋白的沉淀方面考慮，溫度要設(shè)置在5℃以下操作，由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，所以ph值也會(huì)影響沉淀，研究發(fā)現(xiàn)，若把蛋白質(zhì)ph控制在等電點(diǎn)0.5ph以上時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度隨之增加。用此法提取的蛋白測(cè)含氮量比稀堿法大大提高。

2蛋白質(zhì)純化方法及研究現(xiàn)狀

2.1依據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小差異的分離技術(shù)

2.1.1離心技術(shù)

離心技術(shù)廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，是分離純化蛋白的重要方法之一，往往需要和其他分離方法共同作用，達(dá)到進(jìn)一步純化分析的目的，包括如差速離心，密度梯度離心等多種方法，差速離心技術(shù)室是依據(jù)物質(zhì)分子沉降速度的差異，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將離心機(jī)速度由低速到高速逐級(jí)遞增，蛋白分子會(huì)依次沉降下來(lái)，達(dá)到分離效果，其特點(diǎn)是離心時(shí)間短，但需要反復(fù)多次離心尚可達(dá)到效果，所得的產(chǎn)物純度也較低，常用于病毒、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離純化;密度梯度離心是依據(jù)沉降速度的差異和浮力密度的差異來(lái)進(jìn)行分析分離的技術(shù)，離心速度固定不變，離心時(shí)間長(zhǎng)，所得產(chǎn)物純度高，易懸浮且生成區(qū)帶，主要用于對(duì)核酸、蛋白質(zhì)復(fù)合體、細(xì)胞、病毒等物質(zhì)的分離純化。

2.1.2凝膠層析技術(shù)

凝膠層析又叫分子篩過(guò)濾，凝膠具有惰性載體的性質(zhì)，通常所帶電荷為零且具有較弱的吸附能力，在較溫和的操作環(huán)境下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)溫度要求范圍廣，可以不需要有機(jī)溶劑，同樣能保持蛋白質(zhì)活性和理化性質(zhì)，分子篩凝膠的篩孔大小有區(qū)別，所以，把凝膠制成凝膠柱，并且柱子的長(zhǎng)度夠長(zhǎng)，便會(huì)起到“篩子”的作用。具體過(guò)程為：蛋白質(zhì)有形狀、分子量等區(qū)別，當(dāng)大分子的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠柱時(shí)，不會(huì)進(jìn)入凝膠分子篩的內(nèi)部，而小分子的蛋白會(huì)進(jìn)去凝膠分子篩內(nèi)部，結(jié)果便是大分子蛋白由于所經(jīng)的路徑短會(huì)先洗脫下來(lái)，而小分子量的蛋白由于會(huì)先進(jìn)入分子篩的內(nèi)部，這樣凝膠會(huì)阻礙蛋白分子的運(yùn)動(dòng)，所經(jīng)路徑長(zhǎng)，所以小分子蛋白會(huì)后洗脫下來(lái)。這種方法對(duì)大小物質(zhì)的篩選能起到很好的篩離功效。所以凝膠層析是根據(jù)物質(zhì)分子量大小來(lái)進(jìn)行分離的手段，因此又稱之為凝膠過(guò)濾或排阻層析等。

2.1.3超濾技術(shù)

超濾技術(shù)是一種以超濾膜為介質(zhì)的分離技術(shù)，膜倆側(cè)有壓力差，這是分離的驅(qū)動(dòng)力，膜的材質(zhì)對(duì)膜分離性能起著重要決定作用，膜的上層為活化層，其厚度約0.1-1.0微米，很薄，決定了膜孔徑較小，能很好的截流小分子粒子;下層是支撐層，主要對(duì)膜的強(qiáng)度起作用。在蛋白質(zhì)分離純化中超濾技術(shù)具有方便實(shí)施，難度相對(duì)較小，成本低，效率高等優(yōu)勢(shì)，除此之外，在蛋白質(zhì)的脫鹽，脫醇，分離分離，內(nèi)霉素去除等過(guò)程中也有廣闊的應(yīng)用前景。超濾技術(shù)成功應(yīng)用于干酪乳清和大豆乳清中蛋白的脫鹽和回收，蛋白截留率高達(dá)94.65%;超濾技術(shù)用于雞蛋蛋清蛋白的分離，具體經(jīng)過(guò)倆次純化步驟，可得到高純度蛋白，這也是根據(jù)蛋白分子量的大小不同的性質(zhì)來(lái)進(jìn)行的，此法獲得的蛋白純度為98.7%，含45%的卵清蛋白。超濾技術(shù)雖優(yōu)勢(shì)明顯，但實(shí)驗(yàn)過(guò)程易產(chǎn)生濃度極化和膜污染等情況，也是目前亟待解決的問(wèn)題。

2.2改變蛋白質(zhì)的溶解度的分離純化技術(shù)

2.2.1溶劑法

在有機(jī)溶劑提取法在實(shí)驗(yàn)室中常用于實(shí)驗(yàn)植物蛋白的提取，例如昂貴的中草藥中有效成分的提取，當(dāng)將溶劑加入到提前準(zhǔn)備的植物材料中時(shí)，溶劑會(huì)通過(guò)細(xì)胞壁擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)，可溶性物質(zhì)即被溶解，溶于有機(jī)溶劑中，依據(jù)的是相似相溶原理。之后可以采用一定的方法將有機(jī)溶劑去除，例如加熱蒸發(fā)，經(jīng)干燥即可獲得制品，產(chǎn)量可觀，但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需注意溶劑對(duì)人體的危害，避免皮膚直接接觸，除此之外，要保持提取物的分散度，這樣可把所需物質(zhì)幾乎全部析出。

2.2.2雙水相萃取法

根據(jù)親和水性高分子聚合物實(shí)際用途，分析水溶液的濃度，形成兩相的結(jié)構(gòu)，當(dāng)兩種聚合物，一種聚合物與適當(dāng)濃度或特定溫度下的親液鹽或是兩種鹽（一種是離散鹽，另一種是親液鹽）在雙水相體系中混合形成，其中，水的比例較高，可以形成二水項(xiàng)相關(guān)系統(tǒng)。在使用此類方式的過(guò)程中，應(yīng)要具體操作，對(duì)蛋白質(zhì)分析技術(shù)進(jìn)行正規(guī)的改革，全面優(yōu)化處理方式。

2.2.3鹽溶法及鹽析法

鹽析方式在使用期間，主要應(yīng)用高濃度的中性鹽成分，對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行合理的處理后，使離析工作效果能符合規(guī)定。最為常用的材料為：硫酸銨成分、硫酸鈉成分與氯化鈉成分等。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，高濃度中性鹽能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行分離，去除水花莫物質(zhì)，并破壞其穩(wěn)定性。在實(shí)際離析期間，需根據(jù)蛋白質(zhì)的實(shí)際特點(diǎn)，采取不同的方式對(duì)其處理，保證PH值在合理范圍內(nèi)。同時(shí)，在離析期間需保證PH值穩(wěn)定性，通常情況下，在PH值超過(guò)7.1的時(shí)候。血清蛋白質(zhì)與硫酸銨相互融合，就可以沉淀。達(dá)到良好的處理效果。同時(shí)，在使用此類方式的過(guò)程中，還要針對(duì)蛋白質(zhì)的實(shí)際分離要求，對(duì)其進(jìn)行合理的分析。徐建國(guó)等人在對(duì)桑椹籽蛋白提取中，得桑椹籽粕研碎，經(jīng)加鹽液、浸提、過(guò)濾、蛋白質(zhì)提取液、鹽析、離心沉淀蛋白、冷凍干澡后得蛋白粉末。

2.3基于電荷不同的分離技術(shù)

2.3.1離子交換層析技術(shù)

在實(shí)際處理期間，還要根據(jù)電荷的性質(zhì)，合理選擇離析方式，篩選最佳的離析方式，以此提升處理工作效果。在此期間，層析介質(zhì)是可以選擇的，分為陽(yáng)離子層析和陰離子層析，選擇合適的層析介質(zhì)條件，有利于提升分離效果，以陰離子為介質(zhì)做交換層析為例，葡聚糖顆粒本身攜帶正電荷，吸附環(huán)境中帶負(fù)電的蛋白質(zhì)陰離子，此時(shí)用帶有不同濃度的負(fù)電離子（如Cl-）溶液進(jìn)行洗柱。洗脫液中的陰離子會(huì)取代蛋白質(zhì)分子。低鹽濃度時(shí)帶電少的蛋白質(zhì)結(jié)合力弱被優(yōu)先洗滌下來(lái)，隨著洗脫溶液中陰離子濃度的不斷提高，帶電量多的結(jié)合緊的蛋白質(zhì)也不斷地被先后洗脫下來(lái)。若用酸堿程度不同的緩沖液進(jìn)行洗柱，隨著層析柱內(nèi)溶液PH的變化，距離其等電點(diǎn)近的蛋白質(zhì)由于不帶電荷而被洗脫下來(lái)。這樣，利用離子交換層析，便將在洗脫過(guò)程中帶電程度不同的蛋白質(zhì)分離開來(lái)了。

2.3.2電泳技術(shù)

電泳技術(shù)越來(lái)越用在食品、環(huán)保、工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域，也是分離純化蛋白質(zhì)的手段之一。用于蛋白質(zhì)分離的電泳技術(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)分子所帶電荷和荷質(zhì)比差異進(jìn)行分離的，離子在給定的電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)，一段時(shí)間后，不同的離子會(huì)由于移動(dòng)速率的不同在電場(chǎng)中拉開距離，移動(dòng)方向與離子本身所帶電荷相反，即在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)方向相反，可以根據(jù)距離的不同以及與介質(zhì)的不同等達(dá)到分離的目的。

3未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)與總結(jié)

由于蛋白質(zhì)特性具有許多不同于其他無(wú)機(jī)分子，及其他小分子有機(jī)物的性質(zhì)，如：物理化學(xué)性質(zhì)的易改變，本身帶有其他配體、輔基離子等特殊的因子，結(jié)構(gòu)功能也復(fù)雜，從而會(huì)使得的分離提取出的蛋白結(jié)晶過(guò)程增加難度。我們回首之前的科學(xué)探索，發(fā)現(xiàn)多數(shù)的結(jié)果會(huì)具有一定的限制性，能只適用所用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，所以到目前為止，我國(guó)還沒(méi)有研究單一的適合所有蛋白都能提取出來(lái)的手段，同樣不能利用合理的措施將純度與分離效果達(dá)到最大值，還需要利用物理與化學(xué)結(jié)合方式對(duì)其分離處理，在多種方法共同起作用的情況下，確保蛋白質(zhì)的分離純度達(dá)到所需要求，全面優(yōu)化技術(shù)手段，滿足現(xiàn)代發(fā)展方面的需求，提升分離水平。

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課題：

北京青少年拔尖人才培養(yǎng)計(jì)劃，科學(xué)課題開題階段聯(lián)合培養(yǎng)實(shí)施方案

（2020年2-4月），學(xué)科名稱：生命科學(xué)，培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室名稱：清華大學(xué)饒子和實(shí)驗(yàn)室（蛋白質(zhì)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），導(dǎo)師姓名：饒子和，職稱或職務(wù)：教授博士生導(dǎo)師，培養(yǎng)學(xué)生姓名及年級(jí)：劉奕飛，基地中學(xué)：北京師范大學(xué)附屬實(shí)驗(yàn)中學(xué)，指導(dǎo)教師：李曉輝，職稱或職務(wù)：特級(jí)教師，北京青少年科技中心北京青少年科技教育協(xié)會(huì)，二零二零年。

第二作者：李明宇清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系

（作者單位：北京師范大學(xué)附屬實(shí)驗(yàn)中學(xué)）