小檗堿對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用及免疫機制*

孫 科， 羅招亮， 胡 琛， 龔廷亮， 唐國華， 吳紹萍

(1. 重慶市中醫(yī)院腦病科， 2. 心內(nèi)科， 重慶 400011)

目前，全球老齡化嚴重，缺血性腦卒中是老年人常見疾病，該疾病日益成為全球關注的健康難題。缺血性腦卒中是臨床常見的心腦血管疾病，主要由于血栓形成、血管畸形造成腦組織局部缺血缺氧而導致神經(jīng)細胞凋亡、壞死，具有發(fā)病率高、死亡率高及致殘率高等特點。腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury, CI/RI)是腦缺血恢復供血后，其功能未能恢復，反而引起較缺血性腦卒中更嚴重的腦機能障礙，常導致神經(jīng)元脫失、變性及功能的改變，影響神經(jīng)信息傳遞和神經(jīng)功能恢復[1]。

小檗堿(BBR)為中藥黃連(Coptischinensis)中提取的主要活性成分。研究顯示小檗堿具有抗炎、抗血栓、抗氧化應激、抗動脈粥樣硬化、調(diào)血脂及抗腫瘤等多種藥理作用[2]。據(jù)報道，小檗堿具有良好的治療缺血性腦卒中及腦缺血/再灌注損傷保護作用[3-4]。但小檗堿對腦缺血/再灌注損傷保護的作用機制研究有待深入。本文擬通過觀察小檗堿干預后腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)功能，考察其對大鼠氧化應激、免疫炎癥反應以及NF-κB-NLRP3信號軸的調(diào)控作用，探討小檗堿對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

小檗堿對照品(批號：110713-201212，中國食品藥品檢定研究院)；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC，批號：20160500，上海靈錦精細化工有限公司)；鼠NO、SOD、GSH-Px、TNF-α、IFN-β及IL-6檢測試劑盒(批號分別為20176020NOM、20174899SODM、20146660GSHM、20175200IFNM、20170052TNFM、20170588IL6M，上海拜力生物科技有限公司)；APC anti-Rat CD4、FITC anti-CD8抗體(美國e Bioscience)；Trizol試劑(批號：20150502，美國Invitrogen公司)；SYBRGreen PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號分別為A5001-1、AA406-1，日本TaKaRa公司)；兔抗NF-κB p65、NLRP3、ASC和caspase-1多克隆抗體(批號分別為ab16502、08063965、2813878和GR202191-1，英國Abcam公司)；β-actin兔抗鼠一抗、HRP標記山羊抗兔IgG二抗、蛋白質(zhì)分子量Marker及BCA蛋白定量試劑盒(批號分別為00021408、00081307、00131456及23072018，北京康為世紀生物科技有限公司)；生理鹽水(批號：2A15090928，浙江莎普愛思藥業(yè)股份有限公司)；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

R-4100型酶標儀(美國Dynatech公司)；FA1004N電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；-80℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)；FACSAriaⅢ型流式細胞儀(美國BD公司)；F6-10手提式電動勻漿機(德國FLUKO公司)；ABI-7300 Real-time檢測儀(美國ABI公司)；D-37520型低溫離心機(賽默飛世爾科技公司)；PowerPac HC高電流電源電泳儀((美國Bio-Rad公司)。

1.3 動物

SPF級的SD大鼠50只，雄性，體重(200.0± 5.2) g，均購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，合格證編號：SCXK(浙2015-0033)。

1.4 造模與給藥

SD大鼠隨機均分為5組：假手術組(Sham組)、模型組(Model組)、小檗堿高中低劑量組(BBR-H、BBR-M、BBR-L組)。適應性飼養(yǎng)一周后，以Longa等線栓法[5,6]腦缺血/再灌注造模方法為參考。其中Sham組僅分離血管，不插入線栓。各組均進行缺血2 h后，再灌注24 h處理。造模成功后2 h灌胃，BBR-H組大鼠給予100 mg/kg小檗堿、BBR-M組大鼠給予50 mg/kg小檗堿、BBR-L組大鼠給予25 mg/kg小檗堿、假手術組及模型組灌以等體積(1.5 ml)的生理鹽水[7,8]。給藥后24 h，麻醉處死，將新鮮全腦組織，濾紙吸干表面水分，稱質(zhì)量后將其置于-20℃冰箱中速凍20～30 min備用。眼眶靜脈叢采血，加大鼠淋巴細胞分離液分離，以3 000 r/min低溫離心15 min，取血清和白膜層備用。

1.5 神經(jīng)功能缺損程度評分

采用Longa法進行神經(jīng)功能缺損程度評分，主要包括提尾反射、行走測試、感覺測試、平衡測試、反射缺失和反常運動，各項目總和記為最終評分：1～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為嚴重損傷[9]。

1.6 腦梗死率的測定

取各組大鼠全腦組織，制成2～3 mm間距行冠狀切片，用配好的1%TTC溶液染色30 min，分離梗死組織呈蒼白色部分并稱質(zhì)量，然后計算腦梗死率(腦梗死率=腦梗死組織質(zhì)量/腦組織質(zhì)量×100%)。

1.7 抗氧化因子活性、細胞因子及NO含量測定

取各組大鼠的血清，按ELISA試劑盒說明書測定SOD、GSH-Px抗氧化酶活性及細胞因子TNF-α、IFN-β、IL-6和NO的含量。

1.8 免疫功能測定

取各組大鼠的白膜層，再分別加入APC anti-Rat CD4和FITC anti-CD8抗體，混勻，40℃避光孵育30 min，標記細胞表面抗原CD4、CD8染色。離心5 min后棄上清，加入PBS 1.5 ml混勻。重復離心5 min棄上清，加入0.5 ml PBS重懸細胞于離心管，立即用流式細胞儀檢測。

1.9 大鼠腦組織中NF-κB-NLRP3信號軸關鍵基因的測定

將大鼠腦組織在勻漿機中迅速勻漿，先按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，符合實驗要求的RNA采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將上述cDNA進行PCR擴增，反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火、延伸45 s，共40個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參基因，在Real-time PCR檢測儀上檢測NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1基因表達。經(jīng)儀器分析得出各個樣品量的Ct值，所有樣品基因均經(jīng)過內(nèi)參均一化處理，然后用公式2-△△Ct計算mRNA的相對表達量，△△Ct計算公式如下：△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)實驗組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)假手術組。各引物由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成，各引物序列見表1。NF-κB p65 上游引物5' GCACAGATACCACCAAGAC 3'，下游引物5' AGCCTCATAGTAGCCATCC 3'。NLRP3上游引物5' CTCGCATTGGTTCTGAGCTCA 3'，下游引物5' AGTAAGGCCGGAATTCACCA 3'。ASC上游引物5' TGGAGTCGTATGGCTTGGAG3'，下游引物5' TGTCCTTCAGTCAGCACACT3'。caspase-1上游引物5' ACTCGTACACGTCTTGCCCTC 3'，下游引物5' CTGGGCAGGCAGCAAATTC 3'。β-actin 上游引物 5' GTGACACCCACTCTTCCACC 3'，下游引物 5' GTGGTCCAGGAGGCTCTTAC 3'。

1.10 大鼠腦組織中NF-κB-NLRP3信號軸關鍵蛋白的測定

按照1∶10(g/ml)的比例加入RIPA裂解液，按BCA蛋白定量試劑盒說明書方法測定所提取的各組大鼠腦組織的總蛋白含量，以確保每組樣本之間的上樣量相同。裂解、提取各組大鼠腦組織蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，將轉(zhuǎn)好的PVDF膜于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，TBST洗滌液漂洗3～4次。加入一抗，4℃孵育過夜。再漂洗3～4次，加入HRP標記的二抗體，室溫孵育2 h，漂洗3～4次?；瘜W發(fā)光檢測底物ECL工作液顯色，采用Image J圖像分析系統(tǒng)對蛋白顯影圖進行灰度分析，分別考察各組大鼠腦組織中NF-κBp65、NLRP3、ASC及caspase-1的蛋白表達水平。

1.11 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 實驗大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分

與Sham組比較，Model組神經(jīng)功能缺損程度評分顯著提高(P<0.01)。BBR-H、BBR-M、BBR-L組神經(jīng)功能缺損程度評分與Model組比較，均顯著下降(P<0.01)，且隨濃度降低，神經(jīng)功能缺損程度評分下降趨勢減少。提示，不同劑量小檗堿治療可減輕腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損程度(表1)。

Tab. 1 Effects of berberine on the scores of neurological deficit in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury n=10)

2.2 實驗大鼠腦梗死率的檢測

與Sham組比較，Model組大鼠腦梗死率顯著上升(P<0.01)。BBR-H、BBR-M、BBR-L組的腦梗死率與Model組比較，均顯著下降(P<0.05)，且可見各劑量組間存在一定量效關系。提示，小檗堿治療可減少腦缺血/再灌注大鼠的腦部的梗死。結果見表1。

2.3 實驗大鼠血清抗氧化指標及細胞因子的檢測

與Sham組比較，Model組大鼠血清中NO、TNF-α、IFN-β、IL-6含量升高，血清中SOD、GSH-Px活性下降(P<0.01)；與Model組比較，BBR-H、BBR-M、BBR-L組大鼠血清NO、TNF-α、IFN-β及IL-6含量顯著下降(P<0.05)，血清中SOD、GSH-Px活性升高，且BBR-H組的變化程度均高于BBR-M、BBR-L組(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Effects of berberine on thelevels of serum antioxidant factors and cytokines in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury n=10)

2.4 實驗大鼠血清T淋巴細胞亞群的檢測

與Sham組比較，Model組大鼠的T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平顯著下降(P< 0.01)。BBR-H、BBR-M、BBR-L組大鼠血清中CD4+、CD8+及CD4+/CD8+水平與Model組比較，均顯著提高(P<0.01)。提示，小檗堿干預24 h后，可提高腦缺血/再灌注大鼠的免疫功能(表3，圖1)。

Fig. 1 Flow result diagram of T lymphocytes induced by berberine in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury n=3)

Tab. 3 Effects of berberine on the levels of T lymphocyte subsets in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury n=3)

2.5 實驗大鼠腦組織中NF-κB-NLRP3信號軸基因與蛋白表達

與Sham組比較，Model組大鼠腦組織NF-κBp65、NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA與蛋白表達量均顯著升高(P<0.01)。與Model相比，小檗堿各組大鼠腦組織NF-κBp65、NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA與蛋白表達量均顯著降低(P<0.05，圖2，表4，表5)，且小檗堿高中低劑量組間具有一定的量效關系。

Fig. 2 Effects of berberine on the expressions of NF-κB-NLRP3 signaling axis-related proteins in brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury

Tab. 4 Effects of berberine on the expressions of NF-κB-NLRP3 signaling axis-related genes in brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury n=10)

Tab. 5 Effects of berberine on the expressions of NF-κB-NLRP3 signaling axis-related proteins in brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury n=3)

3 討論

我國每年約300萬人死于缺血缺氧性心腦血管病[10]，嚴重危害人類健康。但臨床上對腦缺血/再灌注損傷的防治手段有限，為目前亟待解決的難題[8]。腦缺血/再灌注損傷(CI/RI)涉及機制較為復雜，涉及氧化應激、炎癥反應、神經(jīng)功能性毒性及機體信號傳導等方面[8,11,12]。

CI/RI會導致機體神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)元脫失、變性及功能的改變，影響神經(jīng)信息傳遞和神經(jīng)功能恢復[1]。本文建立腦缺血/再灌注損傷大鼠模型，考察小檗堿干預后對CI/RI大鼠神經(jīng)功能的治療作用。結果發(fā)現(xiàn)，小檗堿治療后，可觀察到大鼠的提尾、行走、反常運動等有明顯改善，進一步研究發(fā)現(xiàn)CI/RI大鼠的神經(jīng)功能缺損程度明顯改善，腦梗死率顯著降低，因此提示小檗堿可有效提升模型大鼠的神經(jīng)功能并較少腦梗死率，與文獻報道具有一致性[13]。

為探究小檗堿治療CI/RI大鼠的作用機制，本文檢測了模型大鼠血清抗氧化因子及細胞因子水平，并考察其免疫功能。據(jù)報道，氧化應激是腦缺血/再灌注發(fā)生過程的一種重要機制，因缺血引起氧和能量供應不足使線粒體功能紊亂，細胞內(nèi)氧自由基生成增加或自由基清除能力不足，氧自由基在細胞內(nèi)積聚，誘導細胞凋亡和壞死，因此降低氧化應激為治療腦缺血的重要策略。NO作為重要的細胞間信號傳遞分子，在腦缺血/再灌注損傷等狀態(tài)下，激活誘導型iNOS能夠催化生成大量NO，其與ROS生成ONOO-和N2O3，誘導氧化應激損傷和亞硝基化損傷，導致SOD、GSH-Px活性降低[14]。因此SOD、GSH-Px、NO均在腦缺血的氧化應激中發(fā)揮重要作用。同時，細胞因子在神經(jīng)系統(tǒng)疾病及相關炎性水腫中起關鍵作用。在缺氧情況下相應細胞會釋放出炎癥介質(zhì)，CI/RI后腦組織內(nèi)會滲入血液系統(tǒng)的成分，導致血源性水腫。繼而導致內(nèi)皮細胞的細胞因子TNF-α、IFN-β及IL-6等的基因表達上調(diào)，釋放炎癥細胞因子，引發(fā)炎癥反應[15]。此外，T淋巴細胞可抑制炎性反應及維持免疫穩(wěn)態(tài)，在CI/RI的防治中亦具有重要作用[16,17]。T淋巴細胞主要分為輔助性CD4+T細胞和殺傷性CD8+細胞，研究認為CD4+T細胞作為IL-2、TNF-α等細胞因子的主要來源，可分泌大量的細胞因子，誘導體液免疫細胞的激活，同時通過信號傳導激活CD8+T淋巴細胞；CD8+T淋巴細胞通過多種機制發(fā)揮免疫作用，兩者體現(xiàn)機體免疫功能強弱[18]。因此，降低氧化應激及細胞因子，提高機體炎癥免疫功能可視為CI/RI研究的有效途徑。本文研究結果顯示，小檗堿可調(diào)節(jié)CI/RI大鼠抗氧化因子(SOD、GSH-Px、NO)及細胞因子水平(TNF-α、IFN-β及IL-6)，以降低機體氧化應激與炎癥反應，提高腦缺血/再灌注損傷大鼠的抗炎免疫功能。

據(jù)文獻報道，機體免疫存在NLRP3炎性體(NLRP3-ASC-caspase-1)，該炎性體可由TLRs(Toll like receptors)信號激活的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導形成[19,20]。NF-κB信號與NLRP3炎性體的信號傳導關系即為NF-κB/NLRP3信號軸，其與調(diào)控機體免疫應激及炎癥相關發(fā)病機制有關[20]。提示NF-κB/NLRP3信號軸可能調(diào)控機體氧化應激及炎癥反應，而影響腦缺血/再灌注的發(fā)生發(fā)展。本文檢測NF-κB/NLRP3信號軸相關蛋白時發(fā)現(xiàn)，小檗堿可顯著降低模型大鼠腦組織NF-κBp65、NLRP3、ASC及caspase-1基因與蛋白表達，提示小檗堿可通過抑制NF-κB/NLRP3信號軸，發(fā)揮對大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護作用。可見NF-κB/NLRP3信號軸可能關聯(lián)機體免疫應激及炎癥反應機制發(fā)揮治療CI/RI作用。

綜上，小檗堿可通過調(diào)控氧化應激與炎癥反應，提高大鼠免疫功能，抑制NF-κB/NLRP3信號軸關鍵靶點表達，從而改善腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)功能及減少腦死亡率，發(fā)揮免疫保護作用。