miRNA-191對前列腺癌的增殖、遷移侵襲能力的影響及其機制*

聶永莉， 湯世敏， 彭 芳， 許 濤， 毛永榮

(1. 國藥漢江醫(yī)院腫瘤科， 湖北 丹江口 442700； 2. 長江大學機能學部， 湖北 荊州 434023； 3. 十堰市人民醫(yī)院腫瘤科， 湖北 十堰 442000； 4. 湖北省腫瘤醫(yī)院病理科， 湖北 武漢 430079)

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，也是男性癌癥相關死亡的主要原因之一。其通常是一種遲發(fā)性疾病，63%的確診男性年齡在65歲及以上，且發(fā)病率逐年上升[1-2]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA-191的異常表達具有致癌性[3-5]。研究報道[6-7]，miRNA-191可調(diào)節(jié)細胞的侵襲和分化，促進細胞外基質(zhì)的形成，并促進轉(zhuǎn)移。miRNA-191在彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)患者中表達上調(diào)，并促進OCI-LY10細胞增殖侵襲。然而目前miRNA-191對前列腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力影響的研究鮮見報道。

磷脂酶C δ1(PLCD1)編碼一種參與能量代謝、鈣穩(wěn)態(tài)和細胞內(nèi)運動的酶，定位于第3號染色體短臂22.3區(qū)，在多個癌癥中經(jīng)常低表達[8]。研究表明，結直腸癌中PLCD1的表達明顯低于癌旁組織，且PLCD1可抑制結直腸腫瘤細胞的增殖和遷移，并促進結直腸腫瘤細胞凋亡，誘導G1 / S期細胞周期停滯[9]。本研究通過檢測前列腺癌細胞系中miRNA-191的表達，建立miRNA-191表達抑制轉(zhuǎn)染細胞，探討miRNA-191靶向PLCD1對前列腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力的影響及其相關機制，為前列腺癌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人正常前列腺細胞RWPE-2和人前列癌細胞系(PC-3、DU-145、LNCa P、22RU1，美國ATCC公司)；胎牛血清(美國 Gibco 公司)；miRNA-191抑制劑和陰性對照(廣州市銳博生物科技有限公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol Reagent、miRNA-191和U6引物(美國Invitrogen公司)；RT-qPCR引物(上海生工公司)；SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)；兔抗PLCD1單克隆抗體(Abcam公司)；HRP標記山羊抗兔IgG(Santa Cruze公司)；雙熒光素酶基因報告檢測試劑盒(Promega)；結晶紫溶液(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

將PC-3、DU-145、LNCa P、22RU1人前列腺癌細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中；將RWPE-2人正常前列腺上皮細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的KSFM培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期各細胞系，采用實時定量PCR法(RT-qPCR法)檢測各細胞系中miRNA-191表達水平，選擇PC-3細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期PC-3細胞接種于24孔板(2×105cells/well)，待細胞融合度達到60%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，分別將5 nmol/L miRNA-191抑制劑和5 nmol/L miRNA-191 Inhibitor NC溶于無血清培養(yǎng)基中；將1 μl Lipofectamine 2000溶于無血清培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min。將miRNA-191抑制劑或miRNA-191 Inhibitor NC與Lipofectamine 2000混合后室溫靜置20 min。轉(zhuǎn)染期間將24孔板培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，每孔400 μl，轉(zhuǎn)染6 h后更換含血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細胞，進行后續(xù)實驗。

1.4 實時定量PCR法(RT-qPCR法)檢測各組細胞miRNA-191和PLCD1 mRNA表達水平

Trizol法提取轉(zhuǎn)染后PC-3細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用實時熒光定量PCR方法檢測miRNA-191和PLCD1基因的表達水平。引物設計如下：miRNA-191正向5'-ACACTCCAGCTGGGCAACCGAATCCCAAAAGC-3'，反向5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6正向5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；PLCD1正向5'-TGTCGCTACTCAAGTGAGTC-3'；反向5'-AGTCCTCCTGAACTTGTAG-3'；β-actin正向5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反向5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。mRNA表達水平按公式(2-△△Ct法)計算。

1.5 Western blot法檢測各組細胞PLCD1的蛋白表達

分別收集轉(zhuǎn)染后各組細胞，加入RIPA 細胞裂解液裂解細胞，振蕩離心后提取總蛋白并測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，經(jīng)過SDS-PAGE分離膠后轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉中封閉1 h，加入PLCD1一抗(1∶1 000稀釋)，4℃冰箱孵育過夜。加入二抗(1∶3 000稀釋)，室溫雜交1 h，ECL化學發(fā)光，于暗室成像拍照，以GAPDH為內(nèi)參，計算各組細胞中PLCD1蛋白相對表達。

1.6 CCK8法檢測細胞增殖水平

將轉(zhuǎn)染后的各組細胞按每孔5×103個細胞數(shù)接種于96孔板，每組3個復孔，每孔培養(yǎng)液總量為100 μl。嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，用酶標儀測定每孔450 nm處的吸光度值，實驗重復3次。

1.7 細胞劃痕法檢測PC-3細胞的遷移能力

將各組細胞培養(yǎng)于6孔板中，用高壓滅菌的200 μl槍頭在孔內(nèi)輕輕劃1-3道痕，用PBS清洗并去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察細胞并拍照，計算相對劃痕寬度。實驗重復3次。

1.8 細胞侵襲法檢測PC-3細胞的侵襲能力

取200 μl細胞(5×105cells/ml)加入上室，下室加入含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基700 μl，于37℃培養(yǎng)24 h。將膜下面的細胞與1%多聚甲醛混合，0.2%結晶紫溶液染色15 min。顯微鏡計數(shù)進入膜下的細胞數(shù)，隨機取10個視野，計算平均值。實驗重復3次。

1.9 雙熒光素酶報告基因分析

采用生物信息學軟件TargetScan選擇PLCD1基因，采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C。分別構建野生型PLCD1-Wt和突變型PLCD1-Mut重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒與miRNA-191 Inhibitor或miRNA-191 NC共轉(zhuǎn)染至PC-3細胞中，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集并裂解細胞，使用雙熒光素酶報告基因分析。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 miRNA-191在不同前列腺癌細胞株中的表達水平

本研究通過RT-qPCR法檢測PC-3、DU-145、LNCa P、22RU1 4種人前列癌細胞系及RWPE-2細胞中miRNA-191的表達水平，發(fā)現(xiàn)與RWPE-2細胞相比，人前列癌細胞中miNRA-191的表達水平顯著升高(P<0.05)，且PC-3細胞中miNRA-191的表達水平較其他3種細胞系顯著上調(diào)(P<0.05，表1)。因此，本實驗選擇PC-3細胞系用于后續(xù)研究。

Tab. 1 Expressions of miRNA-191 in different prostate cancer cell n=3)

2.2 各組細胞增殖能力比較

與空白對照組相比，miRNA-191 Inhibitor組細胞增殖受到抑制(P<0.05)，而miRNA-191 NC組細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與miRNA-191 NC組相比，miRNA-191 Inhibitor組細胞增殖能力顯著降低(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of PC-3 cell proliferation ability, migration and invasion in Different Groups n=3)

2.3 miRNA-191對PC-3細胞遷移及侵襲能力的影響

與空白對照組相比，miRNA-191 Inhibitor組細胞相對劃痕寬度增加，細胞侵襲水平顯著降低(P<0.05)，而miRNA-191 NC組細胞相對劃痕寬度和細胞侵襲水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與miRNA-191 NC組相比，miRNA-191 Inhibitor組細胞相對劃痕寬度增加，穿膜細胞數(shù)顯著減少(P<0.05，表2，圖1)。

Fig. 1 Effects of miRNA-191 on migration and invasion of PC-3 cells

2.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiRNA-191與PLCD1的靶向關系

miRNA-191與PLCD1基因3’UTR存在互補結合位點，miRNA-191和PLCD1能夠靶向結合，見圖2。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，轉(zhuǎn)染野生型PLCD1基因表達載體WT-3’UTR后再轉(zhuǎn)染miRNA-191 Inhibitor細胞的熒光素酶活性與再轉(zhuǎn)染miRNA-191 NC組顯著升高(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型PLCD1基因表達載體Mutant-3’UTR后，再轉(zhuǎn)染miRNA-191 Inhibitor的PC-3細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3)。

Fig. 2 miRNA-191 targeted combination with PLCD1 3'UTR

Tab. 3 Effect of microRNA191 on migration and invasion of PC-3 cells

2.5 各組PLCD1蛋白及mRNA表達水平

與空白對照組相比，miRNA-191 Inhibitor組細胞中PLCD1蛋白及mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，而miRNA-191 NC組細胞中PLCD1蛋白及mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與miRNA-191 NC組相比，miRNA-191 Inhibitor組細胞中PLCD1蛋白及mRNA表達水平顯著升高(P< 0.05，表4，圖3。)

Tab. 4 Expression levels of PLCD1 protein and mRNA in each group

Fig. 3 Expression level of PLCD1 protein in each group

3 討論

前列腺癌是泌尿外科最具挑戰(zhàn)性的惡性腫瘤之一，隨著血清前列腺特異性抗原(PSA)篩查的普及，前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但其具體病因尚不明確。因此，了解參與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關鍵基因，深入探討前列腺癌的相關分子機制[10-11]，對前列腺癌的防治具有重要意義。miRNA-191在多種癌癥中呈高表達，可促進癌細胞增殖、抑制凋亡，并啟動上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[12-15]。磷脂酶C(PLC)在激素分泌、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、生長因子信號、膜轉(zhuǎn)運等胞內(nèi)信號通路中發(fā)揮重要作用。PLCD1基因編碼的酶能夠調(diào)節(jié)能量代謝、鈣穩(wěn)態(tài)及胞內(nèi)信號通路，其在許多腫瘤中被確定為抑癌基因，包括食管鱗狀細胞癌、胃癌及乳腺癌等[16-17]。

本研究通過RT-PCR法檢測PC-3、DU-145、LNCa P、22RU1 4種人前列癌細胞系及RWPE-2細胞中miRNA-191的表達水平，發(fā)現(xiàn)與RWPE-2細胞相比，人前列癌細胞中miNRA-191的表達水平顯著升高，且PC-3細胞中miNRA-191的表達水平較其他3種細胞系顯著上調(diào)。因此，本研究選擇PC-3細胞系作為研究對象用于后續(xù)研究。在轉(zhuǎn)染miRNA-191抑制劑后，PC-3細胞PLCD1表達水平較空白對照組和miRNA-191 NC group組顯著升高。進一步采用生物信息學驗證miRNA-191與PLCD1的靶向關系，結果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染野生型PLCD1基因表達載體WT-3’UTR后再轉(zhuǎn)染miRNA-191 Inhibitor細胞的熒光素酶活性與再轉(zhuǎn)染miRNA-191 NC group組顯著升高；而轉(zhuǎn)染突變性PLCD1基因表達載體Mutant-3’UTR后，再轉(zhuǎn)染miRNA-191 Inhibitor的PC-3細胞熒光素酶活性差異沒有統(tǒng)計學意義。因此，PLCD1基因是miRNA-191的靶基因。

miRNAs是一類可對基因表達進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子，通過靶向作用mRNA的3’UTR，降解靶mRNA或者抑制其翻譯，調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等多種生物功能，其作為人類癌癥的診斷生物標志物發(fā)揮著至關重要的作用[18]。有研究報道，miRNA-191在人乳腺癌細胞中特別是ER(+)乳腺癌中高表達，轉(zhuǎn)染miRNA-191抑制體后，MCF-7細胞增殖、侵襲能力明顯受到抑制[19]；另有研究發(fā)現(xiàn)，PLCD1作為重要的增殖抑制基因，可阻礙細胞周期的進程進而抑制細胞增殖。轉(zhuǎn)入PLCD1可促進CAPAN-1和BXPC-3胰腺癌細胞的凋亡并使細胞周期阻滯于G0/G1期，同時抑制其增殖、侵襲和遷移[20]。Mu等[21]研究發(fā)現(xiàn)PLCD1可通過誘導G2/M細胞周期停滯和凋亡，在體外對人乳腺癌細胞具有顯著的抗增殖作用。本研究在轉(zhuǎn)染miRNA-191抑制劑后，PC-3細胞增殖能力受到抑制，相對劃痕寬度增加、細胞侵襲個數(shù)減少；提示miRNA-191可促進PC-3細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，PLCD1基因是miRNA-191的下游靶基因，其表達被miRNA-191抑制。miRNA-191在前列腺癌中發(fā)揮癌基因的作用，可通過靶向調(diào)控PLCD1對PC-3細胞的增殖、遷移和侵襲具有一定的促進作用。因此，miRNA-191作為潛在前列腺癌miRNA治療的候選基因提供了重要的依據(jù)。