補腎壯骨顆粒對去卵巢大鼠血清GH和IGF-1及其骨組織中受體表達的影響*

蘇海容， 程文姚， 袁秋虹， 歐陽菁， 鄧偉民,3△

(1. 中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院康復科， 2. 中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院軍隊傷病員管理科， 廣東 廣州 510010； 3. 前海人壽廣州總醫(yī)院康復科， 廣東 廣州 511300； 4. 廣州中醫(yī)藥大學2017級在讀博士研究生， 廣東 廣州 510405)

生長激素(growth hormone,GH)對人的影響重大，主要表現(xiàn)為青年時期骨長度的生長和成年后骨量的維持。而胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)作為GH刺激肝臟產生的激素對骨代謝同等重要。GH和IGF-1分別與成骨細胞上的GH受體(growth hormone receptor,GHR)和IGF-1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)結合可刺激成骨細胞的增殖和分化，從而增加骨密度(bone mineral density,BMD)。在垂體發(fā)育過程中，雌激素(estrogen,E2)可引起GH細胞的增殖與分化，在成年時，可維持垂體GH細胞的數(shù)量[1]。有研究發(fā)現(xiàn)激素替代治療(estrogen replacement theropy,ERT)可提高卵巢切除骨質疏松大鼠股骨BMD和血清GH、IGF-1水平[2,3]，E2直接與下丘腦雌激素受體(estrogen receptors, ER)結合，一方面可能通過生長激素釋放激素的增加間接使GH分泌增加，另一方面可能直接作用于垂體前葉的生長激素細胞從而增加GH的分泌[4]。但長期E2治療可能增加冠心病和乳腺癌發(fā)生率以及腦卒中風險，由于長期激素替代治療治療弊大于利，激素替代治療不再推薦用于絕經后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis,PMO)預防和治療的一線藥物。因此，尋找一種E2作用類似但副作用小的治療藥物具有重要意義。補腎壯骨顆粒治療PMO療效肯定，副作用小，團隊前期對其作了大量相關研究[5,6-8]，但其具體作用機理仍須進一步探討。本研究通過去卵巢建立骨質疏松大鼠模型，運用補腎壯骨顆粒干預去卵巢骨質疏松大鼠，同時選用治療PMO療效確切的西藥戊酸雌二醇作為陽性對照組，對比觀察補腎壯骨顆粒促進骨形成的效果，推測補腎壯骨顆粒促進去卵巢骨質疏松大鼠骨形成的作用可能是通過調控血清GH和IGF-1濃度及其骨組織中受體的表達水平實現(xiàn)的，為臨床應用治療提供更多的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

6月齡SPF級SD未育雌性大鼠48只，體重273±21.3 g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2016-0041。適應喂養(yǎng)7 d后，大鼠隨機分為12只假手術組(SHAM)和36只手術組(OVX)，建立去卵巢骨質疏松模型后，手術組隨機分為模型組(OVX組)，戊酸雌二醇(E2組)，補腎壯骨顆粒組(BSZG組)，每組12只。

1.2 實驗藥物

補腎壯骨顆粒由龜板膠、鹿角膠、水蛭、生地、淫羊藿、山藥、骨碎補等中藥組成(10 g/袋,南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，批號15K04001)。戊酸雌二醇(E2)(補佳樂，1 mg/片，德國先靈公司生產，廣州先靈藥業(yè)有限公司分裝，國藥準字J20030089)，由南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科提供。

1.3 實驗主要試劑及儀器

試劑：GH一抗抗體(abcam公司生產)，GH二抗為山羊抗兔鼠通用二抗(上?；蚩萍脊旧a)，TRIzol Reagent(天根生產)，逆轉錄試劑盒(DBI生產)，熒光定量PCR檢測試劑盒(Genecopies生產)，大鼠生長激素(GH)ELISA試劑盒(酶免生產)，大鼠胰島素樣生長因子1(IGF-1)ELISA試劑盒(酶免生產)。儀器：臺式高速離心機(SCIlogex公司生產)，純水儀(重慶艾科浦生產)，熒光定量PCR儀(ABI生產)，微量核酸定量儀(Merinton生產)，基因擴增儀(珠海黑馬生產)，多功能酶標儀(南京東華電子公司)，光密度及陽性細胞分析軟件采用Image J，美國GE雙能X線骨密度儀(型號：Prodigy由通用電氣(中國)有限公司生產)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模 術前禁食6 h，無菌條件下，按3 ml/kg水合氯醛(濃度為10%)進行腹腔注射，俯位固定，于腰椎兩側旁約1 cm處縱行切開皮膚，皮下及肌肉組織分離后，手術組找到雙側卵巢，子宮角處結扎后摘除，SHAM組大鼠僅切除卵巢周圍與卵巢組織大小相當?shù)闹窘M織。術后大腿肌肉注射40 KU/(kg·d)青霉素，連續(xù)用藥3 d，以防術后感染。

1.4.2 給藥方法 術后2周，各組大鼠均存活。各組大鼠每日定時灌胃給藥1次，BSZG組給予補腎壯骨顆粒最佳治療劑量為2.5 g/(kg·d)[5]，給藥濃度為0.25 g/ml。按照人與動物體表面積比值折算得等效給藥劑量，E2組給藥量為0.071 mg/(kg·d)，給藥濃度為7.1 μg/ml，SHAM組及OVX組灌服等量生理鹽水10 ml/kg。每周稱量體重1次，根據(jù)體重調整受試藥物劑量。連續(xù)給藥3個月后，每組隨機選取半數(shù)大鼠取材，剩下繼續(xù)前干預至6個月末取材。

1.4.3 取材 最后一次灌胃后2 h，每組隨機選取半數(shù)大鼠麻醉，活體測定其脊柱及股骨頸BMD，酒精浸泡下半身消毒，隨后腹主動脈取血，靜置2h，即時分離血清，3 000 r/min離心5 min后，吸取血清置-80℃冰箱保存。取完血標本后迅速處死，取出垂體，用濾紙吸干，再用4%多聚甲醛固定，垂體放入該固定液后固定4 h( 4℃)，梯度酒精脫水,常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm。迅速取其左側脛骨，剔凈其上軟組織后，0.9%生理鹽水洗凈后用無菌紗布包裹放于-20℃保存。

1.4.4 指標檢測 骨密度儀檢測，重點檢測部位為脊柱和股骨。ELISA法檢測血清GH及IGF-1濃度，qPCR法檢測左側脛骨組織GHR、IGF-1R的表達水平(GHR引物序列為：GAATGTCCGAGACAGCAGATAC,IGF-1R引物序列為CAATATC A CAGACCCGGAAGAG)。電子顯微鏡和JVCCCD攝像頭攝像采集腦垂體免疫組化片,顯微放大倍數(shù)40×，垂體GH免疫反應陽性細胞的檢測系統(tǒng)通過每張切片隨機選10個不重疊的視野，計數(shù)每個視野細胞數(shù)。最后采用Image J軟件分析光密度值。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 補腎壯骨顆粒對去卵巢大鼠脊柱及股骨BMD的影響

股骨BMD比較：(1)兩階段干預后均表現(xiàn)：OVX組較SHAM組下降(P<0.05)；BSZG組較OVX組高(P<0.05),與SHAM組比較不具統(tǒng)計學差異(P>0.05)，BSZG組及E2組與SHAM組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。(2)干預3個月后，E2組與OVX組、BSZG組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，6個月后，E2組較OVX組高(P<0.05)，與BSZG組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表1)。

脊柱BMD比較：(1)兩階段干預后均表現(xiàn)：OVX組較SHAM組下降(P<0.05)；BSZG組和E2組均較OVX組上升(P<0.05)，但兩藥物干預組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。(2)干預3個月后，兩藥物干預組與SHAM組比較無統(tǒng)計學差異(P> 0.05)；干預6個月后E2組低于SHAM組(P< 0.05，表1)。

Tab. 1 Femoral and vertebral BMD of rats in each group(g/cm2， n=6)

2.2 補腎壯骨顆粒對去卵巢大鼠血清GH/IGF-1水平的影響

大鼠血清IGF-1水平比較：(1)兩階段干預后均表現(xiàn)為：OVX組低于SHAM組(P<0.05)；BSZG組高于OVX組高(P<0.05)，與SHAM組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。(2)干預3個月后，E2組與OVX組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，低于SHAM及BSZG組(P<0.05)；6個月后，E2組較SHAM、OVX及BSZG組低(P<0.05，表2)。

血清GH水平比較：(1)兩階段干預后均表現(xiàn)為：OVX組較SHAM組下降(P<0.05)；BSZG和E2組均較OVX組上升(P<0.05)，兩藥物干預組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。(2)干預3個月后，E2組較SHAM組低(P<0.05)，BSZG組與SHAM組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；干預6個月后，兩藥物干預組與SHAM比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表2)。

Tab. 2 Comparison of serum IGF-1and GH expressionlevels in each group(ng/ml, n=6)

2.3 補腎壯骨顆粒對去卵巢大鼠脛骨GHR及IGF-1R表達水平的影響

IGF-1R相對表達水平比較：兩階段干預后均表現(xiàn)為：(1)OVX組較SHAM組下降(P<0.05)。(2)BSZG組和E2組均OVX組上升(P均<0.05)，兩藥物干預組組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，兩藥物干預組與SHAM組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表3)。

GHR相對表達水平比較：(1)兩階段干預后均表現(xiàn)為:OVX組較SHAM組下降(P<0.05)；BSZG組和E2均較OVX組高(P均<0.05)。(2)干預3個月后，E2組較SHAM組和BSZG組低(P均< 0.05)；但干預6個月后，E2組與SHAM組及BSZG組比較無統(tǒng)計學差異(P均>0.05，表3)。

Tab. 3 Comparison of the relative expression levels of left tibial GHR and IGF-1R in rats in each group(ng/ml, n=6)

2.4 補腎壯骨顆粒對去卵巢大鼠垂體光密度及陽性細胞數(shù)的影響

光密度值比較：兩階段干預后均表現(xiàn)為：(1)與SHAM組相比，OVX組有所下降(P<0.05)。(2)BSZG組和E2組均較OVX組升高(P均<0.05)，兩藥物干預組比較差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表4，圖1)。

GH陽性細胞數(shù)比較：兩階段干預后均表現(xiàn)為：(1)OVX組較SHAM組下降(P<0.05)。(2)BSZG組和E2組均較OVX組上升(均P<0.05)；兩藥物干預組組間比較差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，與SHAM組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05，表4，圖1)。

Tab. 4 Comparison of optical density and GH cell count of pituitary immunostaining in each n=6)

Fig. 1 The pituitary gland (10×), The GH cells were observed by pituitary gland immunohistochemistry (20×)

2.5 骨密度與有關變量之間的相關性分析

血清GH和IGF-1濃度、骨組織GHR和IGF-1表達水平與股骨BMD呈正相關(分別為r=0.725，P<0.01；r=0.469，P<0.01；r=0.660，P<0.01；r= 0.648，P<0.01)；血清GH和IGF-1濃度、骨組織GHR和IGF-1表達水平與脊柱BMD呈正相關(分別為r=0.707，P<0.01；r=0.429，P<0.01；r= 0.573，P<0.01；r=0.630，P<0.01)。

2.6 大鼠血清GH水平與垂體GH免疫染色光密度值及陽性細胞數(shù)的相關性分析

血清GH濃度與光密度值、陽性細胞數(shù)呈正相關(分別為r=0.721，P<0.01；r=0.829，P<0.01)。

3 討論

骨質疏松癥的中醫(yī)基本病機為腎虛、脾虛及血瘀，以腎虛為根本，血瘀為重要病因。補腎壯骨顆粒正是基于此種理論組方而成，主要包括鹿角膠、龜板膠、淫羊藿、生地、骨碎補、山藥、水蛭等成分。淫羊藿、鹿角膠、骨碎補可補腎強筋、益精填髓。龜板膠、生地可補腎精，益陰血。山藥可健脾和胃，養(yǎng)后天脾胃以充養(yǎng)先天之腎精。水蛭、三棱活血祛瘀止痛。前期研究發(fā)現(xiàn)臨床使用該方治療PMOP取得了公認的良好效果，補腎壯骨顆?？梢栽黾覤MD及骨礦含量、降低骨折率、緩解疼痛及改善骨代謝情況，具有良好的成本-效果比[6,7]。補腎壯骨顆?？商岣呷ヂ殉泊笫笱錏2水平及股骨雌激素受體α(estrogen receptor α,ERα)和雌激素受體β(estrogen receptor β,ERβ)的表達，效果優(yōu)于E2治療[8]。絕經后骨質疏松癥患者血中GH、IGF-1和IGFBP3水平下降，與BMD、血清E2水平呈正相關[9,10]。因此，可以推測補腎壯骨顆粒的“補腎健骨”功效可能是經由E2調控GH/IGF-1軸的表達水平實現(xiàn)。

IGF-1和GH是調節(jié)人一生骨平衡的主要因素，它們決定青春期前骨的生長長度、成熟和最大骨量的獲得，成年后則主要表現(xiàn)為對骨量的維持。大鼠成骨細胞系上表達GHR是GH發(fā)揮細胞增殖作用的一個重要因素[11]，GH結合成骨細胞上的GHR，從而促進其有絲分裂。當成骨細胞上的GHR缺乏時，IGF-1增殖和抗凋亡的作用減弱[12]。有研究發(fā)現(xiàn)成骨細胞IGF-1R缺乏小鼠成骨細胞分化降低、骨密度下降，同時發(fā)現(xiàn)，高齡野生型小鼠的IGF-1R較低齡的明顯降低[13]。成骨細胞上的IGF-1R與配體IGF-1結合，可促進成骨細胞的增殖與分化，成骨細胞上IGF-1R基因敲除大鼠成骨細胞數(shù)量減少、骨重建率下降和松質骨密度下降及微觀結構異常[13]?？梢?，IGF-1/GH軸對骨代謝平衡維持的重大作用。

有研究發(fā)現(xiàn)雌激素可促進大鼠生長激素細胞的增殖，大鼠下丘腦中GH釋放因子神經細胞、生長激素抑制素神經細胞和垂體GH細胞均含有雌激素受體，此為E2影響GH水平提供了證據(jù)[14]。本研究顯示，OVX組大鼠血清GH及IGF-1濃度、脛骨組織GHR及IGF-1R水平、腦垂體光密度值、GH陽性細胞數(shù)和脊柱BMD均較SHAM組低，E2干預3個月及6個月后，以上指標均有上升，與前研究中E2可影響GH細胞的增殖和分泌功能結論相符，同時也說明了E2治療骨質疏松可能的作用機制。補腎壯骨顆粒組大鼠血清GH及IGF-1濃度、脛骨組織GHR及IGF-1R水平、腦垂體光密度值、GH陽性細胞數(shù)較OVX組上升，與E2組比較未見明顯差異。結合團隊前期研究發(fā)現(xiàn)補腎壯骨顆?？商岣呷ヂ殉泊笫笱錏2水平[11]，考慮補腎壯骨顆?？赡芡ㄟ^提高血清E2表達水平調節(jié)GH/IGF-1的分泌。補腎壯骨顆粒干預3個月后股骨及脊柱BMD均所上升，與E2組干預3個月時只有脊柱BMD上升相比，說明在干預早期，對BMD的提高方面補腎壯骨顆粒較E2更具優(yōu)勢。干預6個月時，兩組藥物干預組的BMD未見明顯差異，說明兩種藥物長期療效相當。因E2的副作用較大，在絕經后骨質疏松癥治療方面，補腎壯骨顆?？赡芨鼮檫m合。相關性分析顯示，血清GH與垂體光密度值、GH陽性細胞計數(shù)呈正相關，E2可能結合下丘腦GH釋放因子神經細胞、GH抑制素神經細胞和垂體GH細胞上的雌激素受體，促進垂體GH細胞增殖和分泌GH。此外，相關性分析顯示股骨與脊柱BMD與血清GH、IGF-1呈正相關，再次驗證了GH和IGF-1對骨代謝的正向調節(jié)作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)補腎壯骨顆?？商岣呷ヂ殉泊笫笱錑H及IGF-1水平和其在脛骨中的受體表達水平、垂體GH細胞數(shù)量和光密度值以及BMD，骨密度的提高可能與補腎壯骨顆粒調節(jié)GH/IGF-1軸的功能有關。