miR-203a靶向及其靶基因?qū)θ橄侔┝馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移的影響*

韓利蓉 , 宋江勤 , 郭飛波 , 張棟武

(1. 湖北省天門市第一人民醫(yī)院， 天門 431700； 2. 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬佛山高明醫(yī)院， 佛山 528500)

微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是一種長度為18～22個核糖核苷酸的非編碼RNA分子，主要通過與mRNA的3’- UTR結(jié)合，通過降解或抑制mRNA來抑制翻譯，從而調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-3]。國內(nèi)外研究均表明，miR-203a參與多種癌癥的生物學(xué)功能，包括增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤等，在不同的腫瘤組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，在肝癌[4]、胃癌[2,5]、膀胱癌[6]、膠質(zhì)瘤[3]等癌組織中miR-203a呈顯著低表達(dá)，在乳腺癌組織中miR-203a顯著高表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)浸潤性小葉癌組織中，隨著臨床分級程度越高，miR-203a表達(dá)越低[7]。DNA損傷反應(yīng)通路的改變是癌癥的特征，DNA損傷的錯誤修復(fù)常常導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定[8]。ATM(ataxia telangiectasia mutated)是DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)的核心組成部分，在DNA雙鏈斷裂時被激活以增強同源重組修復(fù)通路，當(dāng)ATM基因沉默或缺失時，得不到及時修復(fù)的受損DNA遺傳給子代，增加了基因組的不穩(wěn)定性，從而加大腫瘤的易感性[9,10]。國內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，ATM基因的缺失或變異與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11,12]，但在不同癌癥中表達(dá)各不相同：在乳腺癌中呈顯著低表達(dá)[13]，在卵巢癌中顯著高表達(dá)[14]。文獻(xiàn)報道，在胃癌中miR-203a和ATM是直接的靶基因調(diào)節(jié)關(guān)系，二者呈顯著負(fù)相關(guān)[2]。另一項研究也發(fā)現(xiàn)miR-203和ATM在散發(fā)性乳腺癌中呈顯著負(fù)相關(guān)[13]。由此，我們推斷在乳腺癌組織中miR-203a和ATM很可能也是直接靶基因調(diào)節(jié)關(guān)系。乳腺癌是中國女性最常見的癌癥，在大中城市，年輕女性中新發(fā)病例和死亡病例均有所上升[15]。因此，對乳腺癌發(fā)病機制尤其是分子層面的研究具有重要的臨床意義。目前，國內(nèi)有關(guān)乳腺癌組織中miR-203a及ATM基因的靶向關(guān)系，以及在淋巴結(jié)已轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移之間是否存在顯著差異性的問題，均鮮見相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究通過RT-qPCR檢測乳腺癌組織和癌旁正常組織中miR-203a及ATM基因的表達(dá)情況，分析二者相關(guān)性(即對上述推斷進(jìn)行驗證)，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，比較在淋巴結(jié)已轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組之間是否存在顯著差異性，旨在為乳腺癌的發(fā)病機制尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制提供醫(yī)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

自2016年12月至2018年12月，在天門市第一人民醫(yī)院病理標(biāo)本庫里收集的30例配對的乳腺癌組織和癌旁正常組織。所有標(biāo)本均為病理活檢標(biāo)本，并經(jīng)病理明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均未經(jīng)任何藥物、化療和放療等治療。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照乳腺癌診療規(guī)范(2011年版)[16]，經(jīng)病理確診為乳腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤者；合并高血壓、糖尿病、高血脂等慢性疾病者；合并心、肝、腎等慢性疾病患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會同意，并經(jīng)患者知情同意并簽字。其中，患者平均年齡(47.21±13.26)歲，平均體重(62.53±8.64)kg。

1.2 試劑與儀器

試劑：TRIZOL-LS(英偉創(chuàng)津)；miRNA的RT-qPCR試劑為丹麥EXIQON的逆轉(zhuǎn)錄、引物和熒光定量PCR試劑盒，包括miRCURY LNATMUniversal cDNA Synthesis Kit、miRCURY LNATMPCR Primer、ExiLENT SYBR?Green master mix；mRNA熒光定量PCR試劑為Takara，包括RNase Free dH20、ROX Reference Dye II、PrimeScripTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM、mRNA forward and reverse primers。儀器：分光光度計(AMERSHAM UlRTROSPEC 2001)；Bio-Rad電泳儀(英國，Bio-Tek)；凝膠成像系統(tǒng)(GENEGENIUS GEL DOC 2000)；普通PCR儀(美國，Bio-Rad)；熒光定量PCR儀(美國，ABI，ViiA 7)；低溫高速離心機(美國，Eppendorf)等。引物序列如下：hsa-miR-203a：MIMAT0000089， GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG (5’-3)；GAPDH：Forward：CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCT；Reverse：CATGGGTGTGAACCATGAGAAGTA；ATM：Forward：ACTATCCCAATACACTGCTGGAGA；Reverse：TTTGAGCAACTGACTGGCAAAC。

1.3 總RNA抽提

按照試劑操作說明書操作，使用TRIZOL-LS從乳腺癌和癌旁正常組織中提取總RNA。使用分光光度計檢測RNA含量、濃度和OD260/OD280值(OD260/OD280值在1.9～2.1，說明純度好)，將純度好的樣品分裝標(biāo)記存放-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行RNA鑒定。

1.4 miRNA的RT-qPCR

按照EXIQON的逆轉(zhuǎn)錄、引物和熒光定量PCR試劑盒的操作說明書進(jìn)行操作，選擇10 μl的反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄在普通PCR儀上進(jìn)行，設(shè)置參數(shù)：輸入20 μmol/L；42℃ 60 min；95℃ 5 min；4℃ 30 min～2 h。將得到的cDNA存于-20℃?zhèn)溆谩晒舛縋CR檢測在熒光定量PCR儀和專用的反應(yīng)管中進(jìn)行，設(shè)置參數(shù)：輸入20 μmol/L；95℃ 10 min 預(yù)變性；40個循環(huán)重復(fù)：95℃ 10 s；60℃ 1 min；ramp-rate 1.6℃/s，即降溫速度；65～98℃，1℃/6 s，即溶解曲線。以U6為內(nèi)參。手動調(diào)節(jié)基線得出CT值,復(fù)3孔取平均CT值用于計算相對表達(dá)量，采用2-△△CT公式計算。

1.5 mRNA熒光定量PCR

按照TAKARA的逆轉(zhuǎn)錄、引物和熒光定量PCR試劑盒操作說明書進(jìn)行操作，選擇20 μl的反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄在普通PCR儀上進(jìn)行，設(shè)置參數(shù)：輸入10 μmol/L；37℃ 15 min；85℃ 5 s；4℃ 30 min～2 h。熒光定量PCR在ViiA 7(ABI)熒光定量PCR儀和專用的反應(yīng)管中進(jìn)行，設(shè)置參數(shù)：輸入20 μmol/ L；95℃ 30 s 預(yù)變性；40個循環(huán)重復(fù)：95℃ 3 s；60℃ 30 s；Melt Curve stage(儀器默認(rèn)，勿改)：95℃ 15 s；60℃ 1 min。以GAPDH為內(nèi)參，數(shù)據(jù)處理同上面的miRNA。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-203a與AMT在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)

miR-203a在乳腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織，ATM在乳腺癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織，兩組比較均有顯著差異(P<0.01,表1)。

Tab. 1 MiR-203a and ATM expression in tumor and adjacent normal tissues n=30)

2.2 miR-203a與ATM在乳腺癌組織中的相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)分析表明，miR-203a和ATM在乳腺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.847,P= 0.000)。

2.3 miR-203a和ATM分別與乳腺癌病理特征相關(guān)性分析

根據(jù)miR-203a相對表達(dá)量的中位數(shù)(0.114)將乳腺癌組分為低表達(dá)組(<0.114)和高表達(dá)組(≥0.114)，根據(jù)ATM相對表達(dá)量的中位數(shù)(0.565)將乳腺癌組分為低表達(dá)組(<0.565)和高表達(dá)組(≥ 0.565)，結(jié)果表明miR-203a和ATM表達(dá)與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移與不同臨床分期的相關(guān)分析均顯著相關(guān)(P<0.05)，而與診斷時的年齡均無相關(guān)(P>0.05, 表2)。

Tab. 2 Correlation analysis between mir-203a, ATM and pathological characteristics of breast cancer, respectively

2.4 miR-203a和ATM在乳腺癌淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移中的表達(dá)差異

miR-203a在淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)高于已轉(zhuǎn)移組，ATM在淋巴結(jié)已轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)移組，兩組比較均有顯著差異(P<0.05,表3)。

Tab. 3 Expressions of mir-203a and ATM in lymph node metastasis or without

3 討論

乳腺癌是目前我國大中城市女性發(fā)病率最高的癌癥。國內(nèi)外學(xué)者均致力于研究乳腺癌的發(fā)病機制尤其是分子層面如miRNA及其靶基因調(diào)控在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)生的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-203a及其靶基因ATM有可能參與其中。miR-203a參與多種腫瘤的生物學(xué)功能，包括增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤等[4]，ATM主要參與DNA雙鏈斷裂引起的損傷修復(fù)反應(yīng)，在維持基因組穩(wěn)定性方面起到重要作用[9]。文獻(xiàn)報道，miR-203a在乳腺癌組織中高表達(dá)[7,17]，ATM基因在散發(fā)性乳腺癌中呈低表達(dá)[13,18]，miR-203的高表達(dá)和ATM的低表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)[13]。有研究已證實，在胃癌中miR-203a和ATM是直接的靶基因調(diào)節(jié)關(guān)系[2]。因此，本研究推測在乳腺癌中miR-203a和ATM也很可能是直接的靶基因調(diào)節(jié)關(guān)系。

miR-203a與AMT在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況：本研究結(jié)果顯示，miR-203a在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，ATM在乳腺癌組織中表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，二者呈顯著負(fù)相關(guān)，驗證了上述推測，提示miR-203a的高表達(dá)和ATM的低表達(dá)共同參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，miR-203a很可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)抑制或沉默其靶基因---ATM基因的表達(dá)，在乳腺癌分子層面的發(fā)病機制中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，結(jié)論與文獻(xiàn)報道相近[7,17]。

miR-203a與ATM在乳腺癌組織中的相關(guān)性：乳腺癌轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌診斷、治療、預(yù)后及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，因此對乳腺腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移方面的機制研究是乳腺癌發(fā)病機制研究中的重中之重。研究表明，乳腺癌組織中miR-203a表達(dá)水平與部分臨床病理特征如診斷年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤類別和腫瘤直徑等因素有關(guān)[7]，miR-203a在侵襲性小葉癌中隨著分期的增加而顯著下調(diào)[7]，ATM蛋白的表達(dá)隨著乳腺癌臨床分期的增加而增強[19]。本研究結(jié)果顯示乳腺癌組織中miR-203a和ATM的表達(dá)高低與不同臨床分期與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，隨著乳腺癌臨床分期越高，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，miR-203a高表達(dá)者占總?cè)藬?shù)的百分率逐漸下降，ATM高表達(dá)者占總?cè)藬?shù)的百分率逐漸升高，提示miR-203a和ATM可能參與了乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程，隨著病程進(jìn)展，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，二者的表達(dá)水平發(fā)生了改變。有研究發(fā)現(xiàn)在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中miR-203a高表達(dá)[7]，在乳腺癌非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系中miR-203上調(diào)，在轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系中miR-203顯著下調(diào)[20]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，隨著乳腺癌遷移侵襲能力的增強，p-ATM表達(dá)量相應(yīng)增加，晚期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤組織中ATM激酶的表達(dá)非?；钴S[21]，當(dāng)ATM基因被敲除或抑制后，乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-203a在淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)顯著高于已轉(zhuǎn)移組，ATM在淋巴結(jié)已轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)移組，證實了作者前文推斷且與上述學(xué)者的研究結(jié)果一致，提示在乳腺癌中晚期，可能通過表觀遺傳機制下調(diào)miR-203a上調(diào)ATM基因表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，推動病程進(jìn)展。由上述結(jié)果推測，miR-203a的過表達(dá)通過靶基因負(fù)性調(diào)節(jié)關(guān)系沉默或抑制ATM基因的表達(dá)在乳腺癌早期其實際上很可能是一種調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲性的保護(hù)機制，隨著病程進(jìn)展，很可能通過表觀遺傳機制抑制miR-203a的表達(dá)且增強ATM基因的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，miR-203a及其靶基因ATM均可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，在乳腺癌早期miR-203a過表達(dá)抑制其靶基因ATM的表達(dá)很可能是一種調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲性的保護(hù)機制，到中晚期下調(diào)miR-203a上調(diào)ATM基因，可能參與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。目前國內(nèi)有關(guān)乳腺癌組織中miR-203a及其靶基因ATM的表達(dá)及其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面的機制研究鮮有報道，本研究樣本量較少，需要大樣本多中心試驗，并在基因?qū)用孢M(jìn)行進(jìn)一步研究確定，為乳腺癌的發(fā)病機制尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制提供更多醫(yī)學(xué)依據(jù)。