鱉甲育肝顆粒對乙醇性肝纖維化大鼠的影響*

韋凌霞， 丁茂鵬， 王志旺， 劉雪楓， 龐亞蓉， 郭 玫

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 蘭州 730000)

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟在慢性炎癥過程中的修復(fù)反應(yīng)。隨著全球酒精食用量的迅速增加，乙醇性肝纖維化(ethanol-induced hepatic fibrosis, EHF)已經(jīng)成為肝病之纖維化的主要病因之一。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein , CREB)是環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)的下游分子，其作為肝纖維化的關(guān)鍵靶點受到了很多關(guān)注。據(jù)報道，在HF過程中，CREB與肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活增值、炎證因子的釋放、細胞外基質(zhì)的沉積及肝纖維化發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系[1-2]。研究顯示，HF過程能夠在有效治療手段下發(fā)生逆轉(zhuǎn)，一旦形成肝硬化則預(yù)后不甚理想[3]，故抗HF是治療多種肝病的主要治療目的，而中醫(yī)藥在治療HF等慢性疾病過程中有明顯的優(yōu)勢。中醫(yī)認為病邪耗傷陰血、相火妄動引起肝陰不足是HF的基礎(chǔ)矛盾，然淤血聚于肝脈，血瘀之癥漸顯，故陰虛氣滯、血瘀癥積是HF過程的基礎(chǔ)病機，因此在“體陰而陰不足”中醫(yī)理論指導(dǎo)下[4]，在育陰軟肝、化瘀消癥治法指導(dǎo)下[5]擬定鱉甲育肝顆粒，其由柴胡、黃芩、山茱萸、鱉甲、白芍、牡丹皮等中藥制成，對慢性肝炎、HF有明顯的治療作用[6]，本次實驗采用乙醇來復(fù)制HF大鼠模型，探討鱉甲育肝顆粒的抗EHF作用及其對CREB的影響，為鱉甲育肝顆粒治療EHF提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥理學(xué)教研室提供的鱉甲育肝顆粒(BiejiaYuganGranule, BYG)，批號：20181206；西雙版納版納藥業(yè)責任有限公司生產(chǎn)的秋水仙堿片(Colchicine)，國藥準字：H53021369，批號：20190203。南京建成生物工研究所生產(chǎn)的羥脯氨酸(Hydroxyproline, Hyp)，批號：20190502；北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)免疫組化試劑盒，批號：YT5121、YP0075。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)的BS1103型電子分析天平，日本Olympus生產(chǎn)的CH-212型光學(xué)顯微鏡，成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)的BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)。

1.3 動物

SPF級SD雄性大鼠，體重200～230 g，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院的蘭州獸醫(yī)研究所提供，實驗動物質(zhì)量合格證號SCXK(甘)2015-0001。甘肅中醫(yī)藥大學(xué)的實驗動物中心飼養(yǎng)，實驗動物設(shè)施使用許可證號SYXK(甘)2015-0005。

1.4 分組、造模及給藥

將大鼠隨機分為空白對照組(Con)、模型對照組(ET)、鱉甲育肝顆粒對照組(BYG)、秋水仙堿組(ET+COL)、鱉甲育肝顆粒低劑量組(ET+LBYG)和鱉甲育肝顆粒高劑量組(ET+HBYG)(n=8)，采用梯度乙醇灌胃法來復(fù)制肝纖維化大鼠模型[7]，大鼠第1～4周灌胃5 g/(kg·d)乙醇，第5～8周灌胃7 g/(kg·d)乙醇，第9～12周灌胃9 g/(kg·d)乙醇，第13～24周灌胃9.5 g/(kg·d)乙醇，其中乙醇劑量計算采用下列公式：乙醇劑量(g) = 無水乙醇體積(ml)×預(yù)配乙醇濃度(%)×0.8(g/ml)，其中空白對照組與鱉甲育肝顆粒對照組大鼠灌胃等量純凈水。在復(fù)制模型的同時每天灌胃相應(yīng)藥物：鱉甲育肝顆粒對照組灌胃鱉甲育肝顆粒5.55 g/kg、秋水仙堿組灌胃秋水仙堿1.0×10-4g/kg、鱉甲育肝顆粒低劑量組灌胃鱉甲育肝顆粒1.85 g/kg、鱉甲育肝顆粒高劑量組灌胃鱉甲育肝顆粒5.55 g/kg連續(xù)給藥24周。其中空白對照組與模型對照組按10 ml/kg灌胃等量純凈水。

1.5 取材、測定指標

實驗第169日，麻醉后處死大鼠，手術(shù)摘取肝臟后用生理鹽水沖洗，立即觀察臟器宏觀變化并計算肝臟宏觀變化指數(shù)(macropathological index of liver, LMPI)，具體半定量標準如下，肝臟表面顏色：鮮紅色計0分，淺紅色計1分，淺黃色計2分，棕黃色計3分；肝臟質(zhì)地軟硬：質(zhì)地柔軟計0分，質(zhì)地較柔軟計1分，質(zhì)地較硬計2分，質(zhì)地變硬計3分；肝臟表面光滑程度：光滑細膩計0分，光滑偶見細顆粒計1分，表面有粗顆粒計2分，表面彌漫性結(jié)節(jié)計3分。在固定位置取肝組織3份，第1份肝組織精密稱重，干燥至恒重后稱重，計算肝組織含水量；第2份肝組織，采用ELISA法嚴格按照試劑盒說明書測定Hyp及膠原蛋白含量；第3份肝組織用多聚甲醛固定，切片經(jīng)HE染色或α-SMA、CREB免疫組化染色，在鏡下觀測肝組織纖維化病理變化以及α-SMA、CREB的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 鱉甲育肝顆粒對乙醇性肝纖維化大鼠肝臟宏觀變化的影響

如圖1所示，空白對照組大鼠肝臟顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟，表面光滑，邊緣銳利，呈正常肝組織形態(tài)；模型對照組大鼠肝臟表面粗糙呈彌漫性結(jié)節(jié)狀，棕黃色，邊緣變鈍，質(zhì)脆易碎。經(jīng)鱉甲育肝顆粒治療后，大鼠肝臟上述肝臟宏觀變化得到明顯改善。對肝臟宏觀變化進行半定量分析，結(jié)果顯示，模型對照組肝臟宏觀變化指數(shù)顯著升高，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；在鱉甲育肝顆粒的干預(yù)下，肝臟宏觀變化指數(shù)明顯降低，與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)。

Fig. 1 Effect of BYG on macroscopical changes of liver in EHF rats

2.2 鱉甲育肝顆粒對乙醇性肝纖維化大鼠肝組織含水量的影響

模型對照組大鼠肝組織含水量顯著升高，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；鱉甲育肝顆粒高、低劑量組大鼠肝組織含水量明顯下降，與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05, 0.01，表1)。

Tab. 1 Effects of BYG on LMPI and water content in liver tissue of EHF rats n=8)

2.3 鱉甲育肝顆粒對乙醇性肝纖維化大鼠肝組織病理學(xué)的影響

在光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)為100倍時觀察，空白對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝板呈索狀排列，脂肪細胞及膠原沉積少見。模型對照組大鼠肝纖維組織增生明顯且相互牽拉，致使肝小葉結(jié)構(gòu)扭曲，肝細胞多見變性、壞死，并有大量脂肪細胞。鱉甲育肝顆粒各劑量組大鼠肝組織上述纖維化病理變化出現(xiàn)不同程度改善(圖2)。

2.4 鱉甲育肝顆粒對乙醇性肝纖維化大鼠肝組織α-SMA表達的影響

大鼠肝組織α-SMA表達鏡下呈棕褐色顆粒狀，對其表達水平進行半定量分析，表2結(jié)果顯示，模型對照組α-SMA表達的平均光密度值顯著增加，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。鱉甲育肝顆粒各劑量組α-SMA表達水平明顯下降，與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05, 0.01)；其中鱉甲育肝顆粒高劑量組下降更加明顯(P<0.01，圖3，表2)。

2.5 鱉甲育肝顆粒對乙醇性肝纖維化大鼠肝組織Hyp含量的影響

模型對照組大鼠肝組織中Hyp的含量顯著增加，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。鱉甲育肝顆粒各劑量組肝組織Hyp的含量明顯下降，與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與鱉甲育肝顆粒低劑量組比較，鱉甲育肝顆粒高劑量組下降幅度更大(P<0.05，表2)。

2.6 鱉甲育肝顆粒對乙醇性肝纖維化大鼠肝組織CREB表達的影響

圖4顯示，大鼠肝組織中CREB的表達呈棕褐色顆粒狀，對其表達水平進行半定量分析，表2結(jié)果顯示，模型對照組CREB表達的平均光密度值顯著增加，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；鱉甲育肝顆粒各劑量組CREB表達明顯降低，與模型對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

Fig. 4 Effect of BYG on the expression of CREB in the liver tissues of EHF rats (×40)

Tab. 2 Effects of BYG on the expressions of α-SMA and Hyp in liver tissues of EHF rats n=8)

3 討論

肝纖維化(HF)是急性肝病后期或慢性肝病過程中肝組織的基本病理變化過程，在多種病理因素的刺激下肝纖維組織增生、沉積并相互牽拉，使肝小葉結(jié)構(gòu)扭曲變形，肝細胞功能紊亂而變性、壞死，代謝障礙而出現(xiàn)大量脂肪細胞[8]。在肝病、HF的過程中，過量飲酒是目前最主要的誘發(fā)因素之一，進入體內(nèi)的乙醇約有90%在肝臟中轉(zhuǎn)化為乙醛，乙醛通過抑制脂肪酸氧化代謝、促進脂肪酸合成而誘發(fā)乙醇性脂肪肝；線粒體受損及物質(zhì)代謝紊亂激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，肝組織在反復(fù)的“創(chuàng)傷-修復(fù)”過程中發(fā)生炎癥反應(yīng)(即乙醇性肝炎)；持續(xù)的代謝紊亂與炎癥反應(yīng)激發(fā)肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞(myofibroblasts, MFB)，合成大量纖維蛋白并沉積于肝組織而引起乙醇性肝纖維化(EHF)[9]，在HSC激活并轉(zhuǎn)化為MFB的過程中可特異性表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，α-SMA收縮使蛋白排列成具有可收縮功能的形式，從而使肝組織在大量纖維蛋白的協(xié)同作用下相互牽拉，致使肝細胞功能紊亂而變性、壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)扭曲變形，故MFB表達α-SMA是HF過程中產(chǎn)生過量ECM的標志性產(chǎn)物[10]。而膠原纖維主要由膠原蛋白構(gòu)成，羥脯氨酸(Hyp)常被認為是膠原蛋白的特有成分，肝組織Hyp含量可間接反映肝纖維化的程度。在HF的治療過程中，中醫(yī)藥逐漸顯示出明顯的優(yōu)勢，在“體陰而陰不足”中醫(yī)理論的指導(dǎo)下擬定的鱉甲育肝顆粒(BYG)，由山茱萸、牡丹皮、柴胡、黃芩、白芍、鱉甲等藥物組成，具有育陰調(diào)肝、軟肝散積之效，臨床上對慢性肝炎、HF有明顯的療效[6]。本次實驗采用梯度乙醇灌胃法來復(fù)制酒精性肝纖維化大鼠模型，實驗24周觀察測定相關(guān)指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝臟表面粗糙呈彌漫性結(jié)節(jié)狀，顯棕黃色，邊緣變鈍，質(zhì)脆易碎，肝臟含水量也顯著升高，肝組織病檢可見肝纖維組織增生，肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)扭曲，肝細胞變性、壞死，并有大量脂肪細胞，肝纖維化特征明顯，表明造模成功。給予BYG干預(yù)后，肝臟在表面顏色、質(zhì)地軟硬及光滑程度等方面得到明顯改善，肝臟宏觀變化指數(shù)明顯下降，肝組織纖維化病理變化出現(xiàn)不同程度的改善，肝組織含水量、Hyp及α-SMA明顯下降，提示BYG對EHF有明顯的治療作用。

cAMP/PKA/CREB信號通路是目前研究的經(jīng)典通路之一，在腺苷酸環(huán)化酶催化下生成的cAMP可激活PKA，活化的PKA使環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)磷酸化，p-CREB入核誘導(dǎo)相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄，從而引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)[11]。以前對CREB及其信號通路的研究主要局限于神經(jīng)系統(tǒng)，近年來研究顯示，cAMP/PKA/CREB信號通路與HF過程中的HSC激活及纖維蛋白表達有密切的關(guān)系[1]。乙醇可通過誘導(dǎo)HSC激活并釋放腺苷受體(AR)來使cAMP的含量升高，從而引起下游PKA、CREB等相關(guān)分子表達上調(diào)[12]。如咖啡因可通過抑制肝星狀細胞cAMP的轉(zhuǎn)化，通過cAMP/PKA/CREB信號通路而發(fā)揮抗HF的作用[13]。在本次研究結(jié)果顯示，BYG各劑量均可下調(diào)CREB的表達而緩解肝纖維化，降低α-SMA的表達水平，其作用強度與秋水仙堿相當，且其療效有一定的量效關(guān)系。提示抑制CREB的活性是BYG抗EHF的機制之一，至于BYG對cAMP/PKA/CREB信號通路其他關(guān)鍵蛋白及其相關(guān)的活性因子的影響尚需進一步研究。