柔木丹改善小鼠肝纖維化的TGF-β1/Smad4信號(hào)通路機(jī)制*

李 倩， 閆曙光， 惠 毅， 李京濤， 魏海梁， 張 紅， △

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心， 咸陽(yáng) 712046； 2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 咸陽(yáng) 712046； 3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 咸陽(yáng) 712000)

肝纖維化是由各種損傷因素持續(xù)作用、誘發(fā)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)過(guò)度活化引起肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理過(guò)程[1,2]。隨著肝纖維化程度的逐漸加重會(huì)引起肝臟結(jié)構(gòu)改變、功能喪失并最終導(dǎo)致肝硬化，進(jìn)一步引發(fā)肝癌。病情一旦發(fā)展到肝硬化、肝癌階段，治療困難，預(yù)后差。因此，阻止或減緩肝纖維化的發(fā)生，是治愈大多數(shù)慢性肝病的核心要素[3]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療肝臟疾病歷史悠久，為減緩、阻斷纖維化進(jìn)展提供了豐富候選藥物[4,5]。柔木丹(roumudan，RMD)是由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝病科常占杰教授創(chuàng)制、防治慢性肝病的院內(nèi)制劑。RMD是由黃芪、皂刺、鱉甲、枳殼、柴胡、赤芍、丹參、川芎、漢防己等組成：方中黃芪甘溫益氣；皂刺、鱉甲軟堅(jiān)散結(jié)；枳殼、柴胡疏肝理氣；赤芍、丹參、川芎活血散瘀；漢防己利濕消腫，諸藥配伍寓“氣行則血行”“血行則瘀散”之意，以達(dá)到柔肝軟堅(jiān)、活血消積之目的，對(duì)慢性乙型肝炎所致肝纖維化具有顯著的阻斷和防治作用[6,7]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究指出：在肝纖維化誘導(dǎo)期，使用RMD對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行治療可有效改善其肝纖維化水平[8]。本實(shí)驗(yàn)采用CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，于肝組織切片顯示出明顯的肝臟纖維化病理特征時(shí)，使用RMD對(duì)肝纖維化小鼠進(jìn)行治療，旨在探索RMD改善小鼠肝纖維化的作用機(jī)制，為RMD的臨床應(yīng)用提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡、SPF級(jí)、雄性BALB/c小鼠，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作均符合陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物自由攝食和飲水，光/暗周期為12 h/12 h。

1.2 藥物及主要試劑

柔木丹[9](由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供，陜藥制字Z20160012)成人使用劑量為30 g/d，根據(jù)公式D鼠(小鼠用藥劑量，g/kg)=D人(人用藥劑量，g/kg)/0.081[10]估算出小鼠灌胃所用的人用藥量的等效劑量為6.2 g/(kg·d)。

α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(CST，美國(guó))；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗體(Affinit，美國(guó))；Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ alpha 1，COL1A1)、Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ alpha 1，COL3A1)抗體(NOVUS，美國(guó))；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(三箭，天津)；山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(博士德，武漢)；即用型免疫組化EliVisionTMplus試劑盒(鼠/兔)、DAB顯色試劑盒(邁新，福州)；羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)測(cè)試盒(建成，南京)；地高辛抗體、NBT/BCIP STOCK SOLUTION(Roche，美國(guó))；探針、引物合成(生工，上海)；RNA提取、反轉(zhuǎn)及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(TaKaRa，日本)。

1.3 主要儀器

NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó))；RM2235石蠟切片機(jī)(Leika，德國(guó))；蛋白電泳系統(tǒng)(Bio-rad，美國(guó))；7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))；正置數(shù)碼顯微鏡(Zeiss，德國(guó))；FluoChem Q凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha，美國(guó))；超低溫冰箱(海爾，青島)。

1.4 動(dòng)物分組、造模及給藥

將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、肝纖維化模型組和RMD治療組3組，每組11只。模型及RMD治療組小鼠腹腔注射20% CCl4(CCl4∶橄欖油=1∶4)，注射量為2.5 ml/kg，空白對(duì)照組以同樣方法注射等量橄欖油，每周2次；第2周起調(diào)整模型及RMD治療組小鼠CCl4腹腔注射量為5 ml/kg(空白對(duì)照組注射等量橄欖油)，每周2次，誘導(dǎo)建立小鼠肝纖維化模型。成模后，模型及RMD治療組小鼠繼續(xù)腹腔注射20%CCl4，注射量為1.5 ml/kg(空白對(duì)照組注射等量橄欖油)，每周1次，與此同時(shí)，RMD治療組使用6.2 g/(kg·d)的劑量進(jìn)行RMD溶液灌胃(空白對(duì)照組、模型組小鼠給予等體積的水灌胃)。治療3周后處死小鼠，采集血液、肝組織樣本，待用。

1.5 肝臟指數(shù)

小鼠腹腔注射CCl45周建立肝纖維化模型，RMD治療3周后處死小鼠(空白對(duì)照組和治療組n=10，模型組n=11)，采集肝臟，測(cè)量小鼠肝臟指數(shù)(Liver index)。肝臟指數(shù)(%)=肝臟重量/小鼠體重×100%。

1.6 血清肝功能指標(biāo)的檢測(cè)

取小鼠血清按照肝功能生化檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)的活性。

1.7 肝臟HYP含量測(cè)定

依照南京建成HYP測(cè)試盒(樣本堿水解法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定肝組織中HYP含量。

1.8 肝臟HE、Masson染色觀(guān)察肝臟組織病理學(xué)變化及膠原分布

小鼠腹腔注射CCl45周建立肝纖維化模型，RMD治療3周后處死小鼠(n=3)，常規(guī)方法[11]對(duì)小鼠肝組織進(jìn)行固定、包埋、切片，HE、Masson染色顯示肝臟組織病理學(xué)變化及膠原分布情況。

1.9 免疫組織化學(xué)染色觀(guān)察肝組織COL1A1和COL3A1的表達(dá)

小鼠肝組織常規(guī)石蠟切片，免疫組織化學(xué)染色觀(guān)察COL1A1(一抗： 1∶300)和COL3A1(一抗： 1∶200)在肝組織的表達(dá)。

1.10 肝臟原位雜交檢測(cè)Smad4的表達(dá)

原位雜交顯示Smad4在肝組織的表達(dá)，雜交探針序列如下：5’-AATCCAGCACGGGGTTTCCTTGATGCTCTGCCTGGGGTAGTCT-3’，地高辛標(biāo)記，鎖核酸修飾。

1.11 Q-PCR檢測(cè)肝組織COL1A1和COL3A1 mRNA表達(dá)

依照說(shuō)明書(shū)使用TaKaRa RNAiso提取小鼠肝組織總RNA，NanoDrop 2000C超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度、A260/280和A260/230比值。采用TaKaRa DRR036A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布的小鼠基因序列，應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。目的基因mRNA表達(dá)量計(jì)算方法采用△△Ct法(以空白組動(dòng)物的目的基因表達(dá)量為1，計(jì)算模型組、處理組動(dòng)物相應(yīng)基因的相對(duì)表達(dá)量)。

Tab. 1 Primer sequences used in Q-PCR in this study

1.12 Western blot檢測(cè)小鼠肝組織α-SMA和TGF-β1的表達(dá)

依照Solarbio高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明提取小鼠肝組織總蛋白，使用碧云天BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定提取蛋白濃度，Western blot檢測(cè)小鼠肝組織α-SMA(一抗?jié)舛龋?∶1 000，二抗?jié)舛龋?∶3 000)及TGF-β1(一抗?jié)舛龋?∶1 000，二抗?jié)舛龋?∶5 000)的表達(dá)并對(duì)陽(yáng)性條帶進(jìn)行灰度分析。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察

CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型5周摘取肝臟，切片。HE染色顯示空白對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞呈多邊形，核仁明顯，胞質(zhì)豐富；肝細(xì)胞以中央靜脈為軸心呈放射狀排列形成肝索；肝小葉結(jié)構(gòu)完整(圖1A，1C)。肝纖維化模型組小鼠肝細(xì)胞變性壞死，并有廣泛的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞(圖1A’，1C’)。Masson染色顯示空白對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)血管有少量膠原沉積(圖1B，1D)。肝纖維化模型組小鼠肝內(nèi)膠原纖維組織增生(圖1B’，1D’)，形成索條狀，纖維間隔增厚，小鼠肝纖維化模型建立。

Fig. 1 Histological changes of hepatic fibrosis induced by CCl4 in mice for five weeks. ( HE, Masson)

2.2 RMD對(duì)纖維化模型小鼠肝功能的影響

如表2所示，CCl4造模8周，對(duì)比空白對(duì)照組，模型組小鼠肝臟指數(shù)(P<0.01)及血清中ALT(P<0.01)、AST(P<0.01)活性顯著升高，表明CCl4可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷；RMD治療3周能顯著降低模型小鼠肝臟指數(shù)(P<0.01)、降低血清中ALT(P< 0.01)和AST(P<0.01)活性，有效改善肝纖維化模型小鼠的肝臟功能。

Tab. 2 RMD affected liver function in mice with liver fibrosis

2.3 RMD對(duì)纖維化模型小鼠肝纖維化發(fā)展進(jìn)程的影響

相對(duì)于空白對(duì)照組，如圖2所示：CCl4造模8周后可見(jiàn)小鼠肝細(xì)胞大量變性壞死，肝小葉間及匯管區(qū)膠原纖維增寬，分隔包繞肝實(shí)質(zhì)，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，形成假小葉(圖2A)；同時(shí)可見(jiàn)肝組織中HYP含量顯著增高(表3，P<0.01)，匯管區(qū)COL1A1、COL3A1大量表達(dá)(圖2B)，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間腹腔注射CCl4可以推進(jìn)肝纖維化發(fā)展至肝硬化狀態(tài)。與模型組比較，RMD治療組小鼠肝組織細(xì)胞壞死減少，排列相對(duì)有序，膠原沉積減少(圖2A)，同時(shí)可見(jiàn)肝組織中HYP含量降低(表3，P<0.05)，肝組織切片COL1A1、COL3A1陽(yáng)性表達(dá)減少(圖2B)。Q-PCR檢測(cè)小鼠肝組織COL1A1、COL3A1 mRNA表達(dá)水平(表3)，結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組COL1A1、COL3A1表達(dá)水平表達(dá)升高(P<0.01)；治療組與模型組相比COL1A1、COL3A1表達(dá)水平降低，差異極顯著(P<0.01)。

Tab. 3 RMD affected collagen deposition of liver fibrosis induced by CCl4 in Mice

Fig. 2 RMD affected collagen deposition of liver fibrosis induced by CCl4 in Mice

2.4 RMD對(duì)TGF-β1/Smads通路各關(guān)鍵因子表達(dá)水平的影響

如圖3、表4所示：CCl4造模8周后，與空白組相比，α-SMA(P<0.01)、TGF-β1(P<0.01)蛋白表達(dá)水平顯著升高；治療組與模型組比較，α-SMA(P< 0.05)、TGF-β1(P<0.05)蛋白表達(dá)水平下降；原位雜交檢測(cè)Smad4表達(dá)結(jié)果顯示(圖3C)：相對(duì)于空白組，模型組小鼠肝組織Smad4陽(yáng)性表達(dá)集中在在匯管區(qū)，表達(dá)升高；治療組對(duì)比模型組，肝組織中Smad4陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域減少、表達(dá)強(qiáng)度減弱。

Fig. 3 Effects of RMD on expression of α-SMA, TGF-β1 and Smad4 in mice livers

Tab. 4 Corresponding densitometric analysis of representative immunoblots shown the ratios of expression levels of α-SMA and TGF-β1 to GAPDH in mice livers

3 討論

CCl4因其誘導(dǎo)肝纖維化模型的高復(fù)制性、與人類(lèi)纖維化病理變化的高相似性成為肝纖維化動(dòng)物模型制作中應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)藥物[12,13]。近年來(lái)研究表明，相對(duì)進(jìn)展期的肝纖維化在去除了損傷因素后是可逆的[14]。CCl4誘導(dǎo)肝纖維化成模后停止注射CCl4，模型動(dòng)物肝臟纖維化可自然恢復(fù)[15]；但若在治療期間維持CCl4原劑量注射，易導(dǎo)致模型組小鼠基本生理狀態(tài)差，甚至死亡。本實(shí)驗(yàn)在小鼠肝纖維化模型建立后，降低模型組與治療組CCl4注射量(1.5 ml/kg，每周一次)，發(fā)現(xiàn)肝纖維化持續(xù)進(jìn)展，但是未發(fā)生動(dòng)物的死亡，提示本造模方法可以防止小鼠肝纖維化自然恢復(fù)，又避免對(duì)模型小鼠過(guò)度損傷引發(fā)死亡，適用于檢測(cè)目的藥物對(duì)肝纖維化模型小鼠的治療作用。

多年臨床實(shí)踐表明，RMD對(duì)慢性乙型肝炎所致肝纖維化有顯著的阻斷和防治作用[6,7]，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。課題組前期使用CCl4誘導(dǎo)昆明小鼠肝纖維化，并于纖維化初期(造模3周時(shí))使用RMD灌胃治療6周，結(jié)果顯示RMD可以有效防治肝纖維化[8]。本實(shí)驗(yàn)使用CCl4誘導(dǎo)BALB/c雄鼠肝纖維化，在造模第5周，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)典型的肝纖維化病理特征。再使用RMD灌胃治療3周，相對(duì)于模型組，RMD可降低纖維化小鼠肝臟指數(shù)，減少肝臟細(xì)胞變性壞死，顯著降低治療組小鼠血清中ALT、AST活性，有效改善肝臟功能，發(fā)揮保肝護(hù)肝的作用；同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)RMD可以抑制肝組織COL1A1、COL3A1的產(chǎn)生、降低肝臟組織HYP含量、抑制肝纖維化模型動(dòng)物肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積，改善肝臟纖維化程度及其組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。上述結(jié)果均證明了RMD不僅在肝損傷-纖維化誘導(dǎo)期，且在肝纖維化發(fā)生后亦可起到治療作用。

已有的研究指出，肝纖維化形成與HSC的異?；罨?、增殖和ECM過(guò)度沉積相關(guān)。抑制HSC的過(guò)度活化，減少ECM的沉積成為業(yè)界防治肝纖維化的共識(shí)[1,2,14]。HSC異?；罨且粋€(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，有許多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路涉及其中。目前認(rèn)為，TGF-β1是誘發(fā)肝纖維化的核心細(xì)胞因子，TGF-β/Smad信號(hào)通路是肝纖維化進(jìn)展中最具有代表性的通路之一[16]。研究發(fā)現(xiàn)：在各種損傷因子作用下，肝臟內(nèi)TGF-β1表達(dá)大量增加，而后TGF-β1與靶細(xì)胞表面的TGF-β受體(TGF-β receptors，TβR)結(jié)合，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)分子果蠅抗生物皮膚生長(zhǎng)因子蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein，Smad)[17]，活化的TβRⅠ與Smad2/3結(jié)合，使Smad2/3 MH2區(qū)SSXS結(jié)構(gòu)域的特定ser磷酸化而活化，而后Smad2/3與胞膜上的TβRⅠ解離，進(jìn)入HSC細(xì)胞漿內(nèi)與Smad4結(jié)合成多聚體并轉(zhuǎn)移入胞核，與靶基因結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，激活目的基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致大量膠原產(chǎn)生，形成肝纖維化。與此同時(shí)，活化的HSC也能合成、分泌TGF-β1，使TGF-β1水平持續(xù)增高，進(jìn)一步加速HSC激活、轉(zhuǎn)化、合成膠原，ECM大量沉積，促使肝纖維化進(jìn)行性加重。α-SMA是HSCs激活的標(biāo)志物，其表達(dá)量反映活化HSCs的數(shù)量。故而，本實(shí)驗(yàn)選取HSC活化通路上3個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)：誘發(fā)信號(hào)TGF-β1[18]、效應(yīng)信號(hào)Smad4[19]和活化信號(hào)α-SMA[20]作為衡量指標(biāo)，檢測(cè)RMD對(duì)肝纖維化小鼠TGF-β/Smads信號(hào)通路的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：使用RMD干預(yù)后，小鼠肝組織HSCs活化過(guò)程被抑制；小鼠肝組織TGF-β1表達(dá)水平顯著降低；小鼠肝臟Smad4 mRNA表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域減少，說(shuō)明TGF-β1/Smads信號(hào)通路受到抑制；表明RMD可以抑制肝纖維化組織內(nèi)TGF-β1/Smads通路的傳導(dǎo)。

綜上所述，RMD通過(guò)遏制TGF-β1/Smads通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制HSC過(guò)度活化和增殖，減少膠原的生成，降低肝臟ECM沉積，進(jìn)而有效減緩CCl4誘發(fā)的肝損傷和肝纖維進(jìn)程，改善肝功能。