人參歸脾丸對(duì)脾不統(tǒng)血證大鼠肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制*

王 丹， 高 峰， 陳 慧， 項(xiàng)偉玲， 駱志顯， 金麗琴△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035； 2. 浙江省人民醫(yī)院， 杭州 310014； 3. 杭州醫(yī)學(xué)院， 浙江 杭州 310053)

脾不統(tǒng)血證是指脾氣虧損導(dǎo)致脾不能統(tǒng)攝血液所表現(xiàn)的證候，脾具有統(tǒng)攝血液的功能，脾氣虛則統(tǒng)血無(wú)權(quán)，血離經(jīng)妄行，從而導(dǎo)致出血，脾不統(tǒng)血證是脾氣虛導(dǎo)致的慢性出血癥狀[1]。臨床表現(xiàn)為便血、尿血、肌衄、齒衄，婦女可見(jiàn)月經(jīng)過(guò)多、崩漏等，常伴有眩暈、神疲乏力、少氣懶言、食少便溏等癥[2]。人參歸脾丸具有益氣補(bǔ)血，健脾養(yǎng)心的功效，主要用于氣血不足、心悸、失眠、食少乏力、面色萎黃和月經(jīng)量少。現(xiàn)代研究表明，脾不統(tǒng)血狀態(tài)下，肝臟功能受損，線粒體自噬機(jī)制紊亂，受損的線粒體不能及時(shí)清除[3, 4]，導(dǎo)致活性氧上升或者細(xì)胞凋亡因子釋放[5]，從而造成細(xì)胞損傷或細(xì)胞凋亡[6-9]，歸脾湯可以有效改善脾虛癥狀，為脾不統(tǒng)血證的研究提供了方向[10-12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察人參歸脾丸對(duì)脾不統(tǒng)血證大鼠的治療效果及其對(duì)肝臟的影響，從細(xì)胞凋亡方面，探討人參歸脾丸對(duì)脾不統(tǒng)血證大鼠的作用機(jī)理，為臨床“與脾相關(guān)”證候的治療提供現(xiàn)代生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，周齡7～8周，250～300g,購(gòu)自蘇州昭衍試驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0006。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

全自動(dòng)生化分析儀(邁瑞醫(yī)療公司)，血細(xì)胞分析儀(邁瑞醫(yī)療公司)，NANO DROP 20000核酸蛋白分析儀(Thermo), S1000TM Thermal Cycler PCR儀(BIO-RAD)，CFX Connect TM熒光定量PCR儀(BIO-RAD),電泳儀(BIO-RAD),紫外分光光度計(jì)(Thermo)，冷凍高速離心機(jī) (Thermo Fisher)，金屬浴(天根生化科技有限公司)、蛋白凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)。人參歸脾丸(北京同仁堂股份有限公司)，低分子肝素鈣(江蘇大同盟制藥有限公司)，RIPA裂解液(碧云天)，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(Thermo),大鼠IL-6和TNF-α的ELISA試劑盒(購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takala),SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Takala),兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體均由杭州華安生物技術(shù)有限公司提供。鼠抗Actin、兔抗caspase3均購(gòu)自Abcam，一抗稀釋液(碧云天)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo), 水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 大鼠模型建立及分組處理

造模方法參照參考文獻(xiàn)[10]，40只SPF級(jí)雄性SD大鼠，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC)10只和實(shí)驗(yàn)組30只，前42 d，實(shí)驗(yàn)組每日游泳30 min，同時(shí)禁食2 d，飲食1 d(飲食失節(jié))，大鼠出現(xiàn)飲食減少、體重減輕、大便溏塞、體溫下降等癥狀；第43～72日，實(shí)驗(yàn)組在游泳力竭、飲食失節(jié)的基礎(chǔ)上，每日皮下注射低分子肝素鈣溶液(1 000 IU/ml,0.2 ml/100 g)，實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)不可逆的皮下出血與便潛血癥狀，即成功構(gòu)建脾不統(tǒng)血證大鼠模型，隨后將實(shí)驗(yàn)組分為模型組(MD)、自然復(fù)健組(NR)和歸脾丸組(GP)；第73～102日，模型組繼續(xù)施加處理因素(游泳力竭、飲食失節(jié)及注射低分子肝素鈣)，自然復(fù)健組和歸脾丸組停止施加處理因素，歸脾丸組每日灌胃人參歸脾丸溶液(歸脾丸加48 ml生理鹽水制成人參歸脾丸溶液，濃度為0.2 g/ml，10 ml/(kg·d))，自然復(fù)健組灌胃等量生理鹽水。

1.4 實(shí)驗(yàn)大鼠血與肝臟樣本的采集

第102日后禁食8 h，4%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取部分血，放入EDTA抗凝真空管中，用于紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量及紅細(xì)胞壓積的測(cè)定；取部分血分離血清，用于肝功能指標(biāo)和細(xì)胞因子的測(cè)定；取肝臟，觀察肝臟顏色、大小及光滑度，部分放在液氮中速凍后置于-80℃冰箱中保存，用于Bcl-2、Bax、Caspase3等蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)。

1.5 大鼠血清肝功能指標(biāo)的測(cè)定

采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肝功能指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)活性、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)活性、總膽紅素(total bilirubin，TBil)和總蛋白(total protein，TP)的含量。

1.6 大鼠紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量及紅細(xì)胞壓積的測(cè)定

采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定血細(xì)胞指標(biāo)，包括紅細(xì)胞數(shù)量(erythrocyte count)、血紅蛋白含量(hemoglobin content)和紅細(xì)胞壓積(hematocrit)。

1.7 大鼠血清IL-6、TNF- 蛋白含量的測(cè)定

1.8 肝組織中Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

通過(guò)RIPA裂解緩沖液裂解大鼠肝組織，使用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。制備12%分離膠與5%濃縮膠，上樣等量的蛋白質(zhì)，采用BIO-RAD電泳儀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，通過(guò)濕轉(zhuǎn)(300 mA,70 min)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2h，Actin一抗(1∶3 000稀釋)、Bcl-2一抗(1∶1 000稀釋)、Bax一抗(1∶1 000稀釋)、Caspase3一抗(1∶1 000稀釋)4℃孵育過(guò)夜，二抗孵育1h,加入ECL發(fā)光試劑，使用蛋白凝膠成像系統(tǒng)顯影，經(jīng)ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 肝組織中Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

采用酚-氯仿一步法提取大鼠肝組織總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入相應(yīng)的引物配制熒光定量反應(yīng)體系20 μl，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA的表達(dá)量。結(jié)果用2-△△Ct表示，即△Ct = Ct值(目的基因)- Ct值(內(nèi)參基因)；△△Ct =△Ct值(實(shí)驗(yàn)組)-△Ct值(對(duì)照組)。引物均由杭州尚亞生物合成，各基因引物序列見(jiàn)下表1。

Tab. 1 Reverse transcription primer sequences and primer length of each gene

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清肝功能指標(biāo)的檢測(cè)

與正常對(duì)照組相比，模型組、自然復(fù)健組和歸脾丸組血清ALT活性、AST活性和TBil含量均顯著升高(P<0.01)，TP含量顯著降低(P<0.01))；與模型組相比，自然復(fù)健組和歸脾丸組血清ALT活性、AST活性和TBil含量均明顯降低，TP含量明顯升高(P<0.01)；與自然復(fù)健組相比，歸脾丸組血清ALT和AST活性均明顯降低(P<0.01)，TP含量明顯升高(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Comparison of liver function indexes in four groups of rats n=10)

2.2 大鼠紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量及紅細(xì)胞壓積的檢測(cè)

與正常對(duì)照組相比，模型組、自然復(fù)健組和歸脾丸組血RBC、HGB和HCT含量均顯著降低(P< 0.01)；與模型組相比，自然復(fù)健組血RBC、HGB和HCT含量均顯著升高(P<0.05)；與自然復(fù)健組相比，歸脾丸組血RBC數(shù)量明顯升高(P<0.05)，HGB和HCT含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

Tab. 3 Comparison of red blood cell count, hemoglobin content and hematocrit in four groups of n=10)

2.3 大鼠血清IL-6、TNF- 含量的測(cè)定

與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量均升高(P<0.05)；與模型組相比，自然復(fù)健組大鼠血清中IL-6含量降低(P<0.05)， TNF-α含量的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，歸脾丸組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量均降低(P<0.05)；與自然復(fù)健組相比，歸脾丸組IL-6和TNF-α含量雖減少，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表4)。

Tab. 4 Comparison of serum IL-6 and TNF-α pro-inflammatory cytokine levels in the four groups of rats (pg/ml， n=10)

2.4 大鼠肝組織中Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.01)，Bax和Caspase3蛋白水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，自然復(fù)健組大鼠Bax和Caspase3蛋白水平明顯降低(P<0.05)，歸脾丸組大鼠肝組織Bcl-2蛋白水平升高(P< 0.05)，Bax和Caspase3蛋白水平明顯降低(P< 0.05)；與自然復(fù)健組相比，歸脾丸組大鼠肝組織Bcl-2蛋白水平顯著升高，Caspase3蛋白水平明顯降低(P<0.05，表5)。

Tab. 5 Comparison of apoptosis-related protein expressions in the four groups of rats n=10)

2.5 大鼠肝組織中Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中Bcl-2 mRNA水平明顯降低(P<0.01), Bax和Caspase3 mRNA水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，自然復(fù)健組大鼠肝組織Caspase3 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，歸脾丸組大鼠肝組織Bcl-2 mRNA水平明顯升高(P<0.05)，Bax和Caspase3 mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與自然復(fù)健組相比，歸脾丸組Bcl-2 mRNA水平明顯升高，Bax mRNA水平明顯降低(P<0.05，表6)。

Tab. 6 Comparison of apoptosis-related protein mRNA expressions in the four groups of rats n=10)

3 討論

脾不統(tǒng)血證是在脾氣虛的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，以脾氣虛和出血為辯證要點(diǎn)。脾氣虛弱，氣血虛虧，固攝無(wú)力，不能攝血，從而導(dǎo)致血液逸出經(jīng)脈，出現(xiàn)各種出血癥狀。本實(shí)驗(yàn)采用多因素造模法-游泳力竭、飲食失節(jié)和皮下注射低分子肝素鈣溶液構(gòu)建脾不統(tǒng)血證大鼠模型。實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)大便搪塞、食欲不振、神疲乏力、皮毛稀疏、毛色晦暗和皮下出血等體征，說(shuō)明已成功構(gòu)建脾不統(tǒng)血證大鼠模型。已有文獻(xiàn)報(bào)道，該模型安全性高且死亡率低，更適用于脾不統(tǒng)血證動(dòng)物學(xué)研究[13, 14]。

細(xì)胞凋亡是肝病發(fā)病機(jī)理中的主要特征，干預(yù)肝細(xì)胞凋亡可以延遲疾病進(jìn)展并降低肝病的發(fā)病率。肝臟中的細(xì)胞死亡主要通過(guò)細(xì)胞凋亡或壞死發(fā)生，細(xì)胞凋亡也是消除受損或感染細(xì)胞并維持組織穩(wěn)態(tài)的生理途徑，細(xì)胞凋亡通路中，Bcl-2抑制凋亡，而B(niǎo)ax促進(jìn)凋亡[15, 16]。自噬會(huì)影響線粒體循環(huán)，從而可以通過(guò)線粒體途徑，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞凋亡[17-19]。肝臟損傷后，血清肝功能指標(biāo)異常，膽汁代謝紊亂，合成功能受損,觀察血清中肝功能指標(biāo)，可以評(píng)估肝臟的功能基本狀況[20]，根據(jù)紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞壓積的變化，可以評(píng)估藥物的治療作用。

該實(shí)驗(yàn)以脾不統(tǒng)血證大鼠作為研究對(duì)象，給予人參歸脾丸治療，通過(guò)觀察大鼠血清肝功能生化指標(biāo)，血紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞壓積，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表達(dá)以及mRNA的表達(dá)，探究人參歸脾丸對(duì)脾不統(tǒng)血證大鼠的保護(hù)作用。大鼠血清肝功能指標(biāo)可以反映肝臟是否損傷，血細(xì)胞檢查可以反映人參歸脾丸對(duì)脾不統(tǒng)血證大鼠是否有保護(hù)作用。人參歸脾丸治療后，大鼠便潛血癥狀緩解，飲食趨于正常，體重進(jìn)行性增加，行動(dòng)較模型組增多，皮毛茂密、有光澤。與模型組相比，血清肝功結(jié)果顯示， AST、ALT和TBil水平相對(duì)降低，TP水平相對(duì)升高；血細(xì)胞結(jié)果顯示，紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞壓積均相對(duì)增加；ELISA結(jié)果顯示，大鼠血清中IL-6和TNF-α蛋白含量均明顯降低;大鼠肝組織抗凋亡蛋白Bcl-2水平相對(duì)升高、促凋亡蛋白Bax和Caspase3水平均相對(duì)降低；大鼠肝組織Bcl-2 mRNA 水平相對(duì)增加、Bax和Caspase3 mRNA 水平均相對(duì)降低。上述結(jié)果表明，脾不統(tǒng)血狀態(tài)下，大鼠肝臟受到明顯損傷，導(dǎo)致炎癥因子、凋亡相關(guān)因子釋放，加劇了細(xì)胞凋亡。人參歸脾丸可以通過(guò)下調(diào)血清AST、ALT和TBil水平，上調(diào)血清TP、血中紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞壓積，下調(diào)IL-6和TNF-α蛋白含量；上調(diào)肝組織抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-2 mRNA水平，下調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase3 蛋白及mRNA水平來(lái)減少凋亡相關(guān)因子的釋放，并降低促炎細(xì)胞因子水平，減少細(xì)胞凋亡,從而保護(hù)大鼠肝臟。歸脾丸組治療效果較自然復(fù)健組好，人參歸脾丸益氣補(bǔ)血，可以改善脾不統(tǒng)血癥狀，有效減少細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)作用。

綜上所述，人參歸脾丸可以減少凋亡相關(guān)因子的釋放，增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制促凋亡因子Bax和Caspase3的表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放，改善肝組織細(xì)胞凋亡狀況，從而對(duì)脾不統(tǒng)血證大鼠起到一定的保護(hù)作用，起到一定的參考作用，進(jìn)而指導(dǎo)臨床用藥。