棉花紅腐病菌不同致病力菌株間毒素活性差異

劉夢(mèng)麗, 李進(jìn), 張軍高, 周小云, 杜鵬程, 郭慶元*, 雷斌*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 烏魯木齊 830052; 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所, 烏魯木齊 830091)

新疆光熱資源豐富，適合發(fā)展棉花生產(chǎn)，現(xiàn)已成為我國(guó)最大的棉花生產(chǎn)、供給基地[1]。然而受連作年限長(zhǎng)、極端天氣不斷增加等因素影響，棉花病害頻繁發(fā)生、損失巨大。立枯病、紅腐病是新疆棉區(qū)苗期主要病害，尤其擬輪枝鐮孢霉(Fusariumverticillioides)引起的棉花紅腐病，近年來發(fā)生危害漸增，并在適宜發(fā)病的條件下，造成缺苗斷壟、產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降[2-3]。擬輪枝鐮孢霉侵入寄主植物后產(chǎn)生的毒素會(huì)抑制植物生長(zhǎng)，導(dǎo)致寄主植物組織細(xì)胞損壞[4]。目前，已在玉米、小麥等農(nóng)作物中分離出擬輪枝鐮孢霉并檢測(cè)到伏馬菌素[5-7]，Seo等[8]從擬輪枝鐮孢霉菌株中分離出2種結(jié)構(gòu)相似的伏馬菌素，并分析了合成伏馬菌素的必需基因。有學(xué)者認(rèn)為鐮孢菌(Fusarium)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等的毒素對(duì)寄主植物形態(tài)及細(xì)胞病理反應(yīng)有顯著影響[9-11]，能影響寄主植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)及生理代謝[12-14]。潘月敏[15]研究發(fā)現(xiàn),擬輪枝鐮孢霉毒素對(duì)棉花胚根有抑制作用，且經(jīng)毒素處理后的棉苗與接種病原菌的棉苗發(fā)病癥狀一致。以上關(guān)于病原菌粗提毒素在致病過程的作用機(jī)制研究主要集中在成分鑒定及其對(duì)寄主植物的毒害作用方面，而對(duì)不同菌株毒素的致病力差異缺乏系統(tǒng)深入研究。

鑒于擬輪枝鐮孢霉毒素液的致毒成分是其侵染過程中的重要因素，并在寄主與病原物的互作中發(fā)揮重要作用，本研究利用3株致病力差異較大的棉花紅腐病菌菌株，分別獲得其粗毒素，研究粗毒素對(duì)棉種萌發(fā)、胚根生長(zhǎng)、幼苗致萎和幼苗保護(hù)酶活性等的影響，旨在探明擬輪枝鐮孢霉致病機(jī)理，明確寄主與病原菌間的互作關(guān)系，為利用擬輪枝鐮孢霉毒素快速鑒定寄主抗病能力提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌株 選用編號(hào)為FAKS15-111、KYJS15-122、FBYL15-111的3個(gè)擬輪枝鐮孢霉菌株作為供試菌株，其中FAKS15-111為弱致病力菌株，KYJS15-122為中致病力菌株，F(xiàn)BYL15-111為強(qiáng)致病力菌株[16]。菌株均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2棉花品種 供試棉花品種‘新陸早82號(hào)’(GossypiumhirsutumLinn.‘Xinluzao 82’)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所化控實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3培養(yǎng)液 選用馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose，PD)培養(yǎng)液作為擬輪枝鐮孢霉的產(chǎn)毒素培養(yǎng)液[15]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1擬輪枝鐮孢霉毒素的提取 參照王立安等[17]方法提取擬輪枝鐮孢霉毒素，略有修改。將病原菌接入PD培養(yǎng)液，調(diào)整培養(yǎng)液pH至9，置于溫度為25 ℃、12 h/12 h光暗交替的人工氣候箱中培養(yǎng)10 d，每隔6 h人工震蕩1次；將培養(yǎng)好的菌懸液用2層紗布過濾掉菌絲，濾液經(jīng)5 000 r·min-1離心，取上清液經(jīng)121 ℃、20 min高壓滅菌，獲得病原菌粗毒素原液。粗毒素原液置于4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2棉花種子發(fā)芽胚根抑制試驗(yàn) 將3株病原菌粗毒素原液依次梯度稀釋，分別稀釋0、2、10、100和1 000倍，將發(fā)芽紙完全浸入不同濃度的粗毒素液中，浸泡24 h；分別在各發(fā)芽紙上均勻擺放50粒飽滿棉種，以蒸餾水浸紙作為對(duì)照(CK1)，每個(gè)處理重復(fù)3次。將裝有種子的發(fā)芽紙放入密封袋中，置于25 ℃培養(yǎng)箱，培育4 d，逐粒檢查棉花種子的萌發(fā)情況，測(cè)定胚根長(zhǎng)度，并計(jì)算萌發(fā)率(G)和胚根抑制率(Ir)[18]。

G=N1/N×100%

Ir=(LCK-LT)/LCK×100%

式中，N1和N分別代表發(fā)芽種子數(shù)和供試種子數(shù)，LCK和LT分別代表對(duì)照胚根平均長(zhǎng)度和處理胚根平均長(zhǎng)度。

1.2.3粗毒素原液處理后的棉苗培育 因粗毒素原液毒素活力最高，毒力最強(qiáng)，本研究采用粗毒素原液作為水培處理溶液。取無菌土培養(yǎng)至兩葉一心的棉苗，用蒸餾水反復(fù)沖洗根系3遍后，分別水培于裝有FAKS15-111、KYJS15-122和FBYL15-111三種病原菌粗毒素原液的三角瓶中，不含毒素液的PD培養(yǎng)液為對(duì)照(CK2)，共計(jì)4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4棉苗致萎試驗(yàn) 分別在水培液處理12、24、36和48 h觀察記載棉苗反應(yīng)情況。植株反應(yīng)級(jí)別分為無反應(yīng)、輕度反應(yīng)、中度反應(yīng)和重度反應(yīng)[15]。無反應(yīng)，植株正常，葉片無萎蔫；輕度反應(yīng)，葉片輕度黃化或輕度卷曲；中度反應(yīng)，葉片大部分卷曲、黃化；重度反應(yīng)，整個(gè)葉片卷曲至枯死。

1.2.5棉苗根部電導(dǎo)率檢測(cè) 分別在水培液處理12、24 、36 和48 h時(shí)，隨機(jī)取出3株棉苗測(cè)定電導(dǎo)率。參照張憲政[19]測(cè)定棉苗根系電導(dǎo)率，并計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率(relative electric conductivity, REC)。

REC=(CB-CCK)/(CA-CCK)×100%

式中，CA和CB分別代表30 ℃水浴處理電導(dǎo)率和沸水浴電導(dǎo)率，CCK指純凈水的電導(dǎo)率。

1.2.6棉苗根系保護(hù)酶活性測(cè)定 分別在水培液處理4、12、24、36和48 h時(shí)，取出棉苗根系，蒸餾水沖凈表面殘留粗毒素液，利用4種酶活測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)分別測(cè)定SOD、PAL、POD和PPO活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株及其不同稀釋濃度粗毒素液對(duì)棉花種子發(fā)芽的影響

不同毒素處理的棉花種子發(fā)芽和胚根抑制結(jié)果見表1，可見，粗毒素原液處理下，3株致病力不同的病原菌毒素溶液對(duì)棉種萌發(fā)率及胚根生長(zhǎng)抑制率的表現(xiàn)有差異，菌株致病力越強(qiáng)，其毒素溶液處理的棉種萌發(fā)率越低，胚根抑制率越高。致病力最強(qiáng)的FBYL15-111菌株毒素處理的種子萌發(fā)率最低，為17.67%，胚根生長(zhǎng)抑制率最高，達(dá)到91.11%。菌株毒素溶液稀釋倍數(shù)越高，棉種萌發(fā)率越高，胚根生長(zhǎng)抑制率越低，當(dāng)毒素液稀釋度為1∶1 000時(shí)，無論病原菌致病力強(qiáng)弱，毒素溶液處理后的棉苗萌發(fā)率與對(duì)照無顯著差異。經(jīng)雙因素方差分析(表2)表明，稀釋倍數(shù)和菌株對(duì)棉苗胚根抑制率均有極顯著影響(P<0.01)；而稀釋倍數(shù)對(duì)棉種萌發(fā)率的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，菌株對(duì)萌發(fā)率具有顯著性影響(P<0.05)。

2.2 粗毒素原液浸根對(duì)棉苗的致萎作用

不同菌株粗毒素原液對(duì)棉花的致萎結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表3，可知，3株致病力不同的菌株所提粗毒素對(duì)棉苗表現(xiàn)出不同程度的致萎作用，其中強(qiáng)致病力菌株(FBYL15-111)所提粗毒素對(duì)棉苗的致萎速度快，致萎能力強(qiáng)。處理36 h后，F(xiàn)BYL15-111的毒素溶液使棉苗子葉和真葉重度卷曲，KYJS15-122、FAKS15-111的毒素溶液處理的棉苗葉片萎蔫、黃化；處理48 h后，F(xiàn)BYL15-111、KYJS15-122毒素液中的棉苗枯死、根部發(fā)生腐爛，而對(duì)照(CK2)棉株生長(zhǎng)正常。

2.3 粗毒素原液處理對(duì)棉苗根部電導(dǎo)率的影響

不同菌株毒素原液處理的棉苗根部電導(dǎo)率結(jié)果(圖1)表明，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，3個(gè)菌株粗毒素原液處理的棉苗根系相對(duì)電導(dǎo)率逐漸升高。前12 h，各處理的棉苗根系相對(duì)電導(dǎo)率差異不大；處理48 h后，3個(gè)菌株粗毒素原液處理的棉苗根系相對(duì)電導(dǎo)率較對(duì)照(CK2)分別高1.48、1.23和0.90倍。由此可知，擬輪枝鐮孢霉毒素處理可使細(xì)胞膜透性增加，且菌株致病力越強(qiáng)，細(xì)胞膜受傷害的程度越大。

表1 不同菌株及其不同稀釋度毒素液處理的棉花種子萌發(fā)率和胚根抑制率Table 1 Germination rate and radicle inhibition rate of cotton seed under different treatments (%)

表2 萌發(fā)率及胚根抑制率雙因素方差分析Table 2 Analysis of variance of germination rate and radicle inhibition rate

表3 不同菌株毒素對(duì)棉苗的致萎作用Table 3 Lethal effect of toxin produced by different strains on cotton seedlings

圖1 棉苗根系相對(duì)電導(dǎo)率Fig.1 Relative conductivity of cotton seedling roots

2.4 不同處理棉苗根系的PAL、PPO、POD及SOD酶活性

由圖2可知，經(jīng)病原菌毒素原液處理后，棉苗根系SOD、PAL、POD和PPO酶活性均呈先增高后降低的趨勢(shì)，不同處理的PAL活性均在處理12 h時(shí)到達(dá)峰值，不同處理的PPO、POD和SOD活性均在處理24 h時(shí)達(dá)到峰值；而對(duì)照處理(CK2)的棉苗根系中4種酶活性在各個(gè)處理時(shí)間段差異不大。毒素處理4 h時(shí)，各處理的4種酶活性均顯著高于CK2處理，其中FBYL15-111、KYJS15-122及FAKS15-111處理的SOD酶活性分別比CK2高出143.17%、118.03%及80.03%。毒素處理12 h時(shí)，各處理PAL酶活力達(dá)到最大值而后逐漸降低，其中FBYL15-111毒素處理的棉苗根系PAL活力最高，達(dá)到(30.79±1.72)U·mg-1蛋白；FBYL15-111毒素處理后SOD酶活性顯著增高，比CK2高出209.66%；POD、PPO酶活性變化不大。毒素處理24 h時(shí)，各菌株毒素處理的SOD、PPO及POD酶活力均達(dá)到最大值，F(xiàn)BYL15-111所提毒素處理的PPO活力變化明顯，達(dá)到(85.74±1.49)U·mg-1蛋白；FBYL15-111的SOD活力上升最快，在處理24 h時(shí)比CK2高出67.99%。毒素處理36 h時(shí)，各處理的SOD、PPO及POD酶活性逐漸下降，致病力弱菌株FAKS15-111的PPO活力與CK2無顯著差異。毒素溶液處理48 h時(shí)，菌株FBYL15-111的PAL、PPO及POD酶活性仍然為最大，與FAKS15-111的SOD酶活性無顯著差異，F(xiàn)AKS15-111與KYJS15-122的POD酶活性差異不顯著。

圖2 棉苗根系的PAL、PPO、POD及SOD活性Fig.2 Activities of PAL, PPO, POD and SOD in roots of cotton seedlings

3 討論

毒素作為病原菌侵染過程重要的致病因子之一，不僅造成植物細(xì)胞和組織凋萎死亡，還產(chǎn)生過量的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，致使植物體內(nèi)一些與抗病相關(guān)的防御性酶的活性發(fā)生改變[20-21]。

馮云程等[22]研究表明，菌株產(chǎn)毒量與菌株致病性強(qiáng)弱呈正相關(guān)，且毒素濃度越高，作用越明顯；還發(fā)現(xiàn)，利用粗毒素對(duì)水稻幼苗進(jìn)行致萎力研究的方法，表現(xiàn)出更高的試驗(yàn)靈敏性。本研究提取不同致病力擬輪枝鐮孢霉菌株毒素侵染棉苗，經(jīng)生物活性測(cè)定表明，致病力不同的菌株所提粗毒素液及其不同濃度溶液對(duì)棉花種子的萌發(fā)率、胚根抑制率均有一定影響；且粗毒素液濃度越高，棉種萌發(fā)率越低，其胚根抑制率越高。此外，菌株致病力越強(qiáng)，其毒素對(duì)棉苗的致萎作用越強(qiáng)。棉苗經(jīng)擬輪枝鐮孢霉毒素液處理后，其根系細(xì)胞由于細(xì)胞膜透性增加，電解質(zhì)外滲，使細(xì)胞浸出液相對(duì)電導(dǎo)率增加，且強(qiáng)致病力菌株對(duì)其相對(duì)電導(dǎo)率影響最大，而對(duì)照處理的相對(duì)電導(dǎo)率變化不大。這一結(jié)論與田雪亮等[23]研究的擬輪枝鐮孢霉粗毒素對(duì)玉米幼苗根系以及對(duì)小麥根系的影響結(jié)果一致。

當(dāng)植物被病原菌侵染時(shí)，植物體內(nèi)的一些與抗病相關(guān)的防御酶被激活，防御酶在植物細(xì)胞抵御外界逆境因子的脅迫過程中起重要作用[24]。SOD、POD、PPO及PAL都是與植物體抗逆相關(guān)的酶，SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害。POD的主要作用是將過氧化氫水解，是評(píng)價(jià)植物組織細(xì)胞老化的一項(xiàng)重要指標(biāo)。PPO通過催化木質(zhì)素及醌類化合物形成，構(gòu)成保護(hù)性屏障從而使植物細(xì)胞免受傷害。PAL是鏈接初級(jí)代謝和苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶和限速酶[25-26]。本研究中，棉苗根部細(xì)胞PAL酶活性在12 h時(shí)就出現(xiàn)最大值，說明在毒素脅迫初期，棉苗就能通過提高細(xì)胞中PAL酶活性來抵抗病原菌侵染，這與張笑宇等[27]對(duì)馬鈴薯黑痣病病原菌毒素的研究結(jié)果一致。然而，研究者在研究毒素脅迫不同作物對(duì)防御酶活性影響所得的結(jié)論有差異，如松針褐斑病菌毒素對(duì)紫莖澤蘭葉片細(xì)胞內(nèi)的酶活性有抑制作用[28]，而玉米大斑病病原菌毒素對(duì)玉米幼根的SOD、PAL、POD、PPO 4種酶活性的影響，均為先升高后降低的趨勢(shì)[29]。本研究中，隨著毒素對(duì)棉苗根系處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD、PAL、POD、PPO 4種酶活性都呈現(xiàn)出先適度升高后逐漸降低的趨勢(shì)，且均在處理12～24 h左右出現(xiàn)最大酶活性。說明棉苗根部細(xì)胞在遇到毒素脅迫時(shí)首先需要一個(gè)適應(yīng)過程，這段時(shí)間防御酶系統(tǒng)逐漸啟動(dòng)，是棉苗體內(nèi)防御酶系統(tǒng)最活躍、生理生化反應(yīng)最強(qiáng)烈的階段。