骶神經(jīng)電刺激對(duì)急性脊髓損傷大鼠腸黏膜免疫屏障功能的影響*

白春宏， 張文麗， 戶士忠

(1. 武警特色醫(yī)學(xué)中心骨科, 天津 300162； 2. 華北理工大學(xué)綜合測(cè)試分析中心, 唐山 063000； 3. 武警天津總隊(duì)第一支隊(duì)衛(wèi)生處， 天津 300222)

急性完全性脊髓損傷( spinal cord injury，SCI)患者腸道功能障礙嚴(yán)重影響患者身心健康，尤其腸道細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致膿毒血癥、敗血癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至出現(xiàn)多器官功能衰竭乃至死亡。Bai 等通過(guò)電刺激兔骶3 神經(jīng)根發(fā)現(xiàn)，該電刺激可以改善兔子的腸道癥狀,減輕菌群移位、內(nèi)毒素血癥[1]。完整的腸道屏障功能主要包括機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障，其中免疫屏障功能平時(shí)維持腸內(nèi)、外微生物平衡，對(duì)抵抗細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥，以及它們所造成的繼發(fā)損傷起到關(guān)鍵作用[2]。有關(guān)骶神經(jīng)刺激( sacral nerve stimulation，SNS) 對(duì)SCI 腸道免疫屏障功能的具體保護(hù)作用仍未被闡明。所以本實(shí)驗(yàn)旨在初步探討SNS 對(duì)SCI 大鼠腸道免疫屏障功能的保護(hù)作用，為其在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 截癱模型建立和電刺激實(shí)施

大鼠麻醉后定位T6棘突，刮毛、消毒。手術(shù)暴露脊髓，F(xiàn)ehlings法98 g動(dòng)脈瘤夾橫行鉗夾約l min，以雙下肢抽搐停止，運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)誘發(fā)電位評(píng)價(jià)完全離斷情況。定位右側(cè)骶3神經(jīng)孔，脫毛、消毒，置人電極，電刺激尾部肌肉收縮確定植入效果，SCI 2 h后電刺激，參數(shù)為：電壓4 V，波寬210 μs，頻率15 Hz，刺激10 s，間歇20 s。每次持續(xù)10 min，間歇10 min，共2 h。早8：00-10：00，晚6：00-8：00兩次(前期實(shí)驗(yàn)確認(rèn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及標(biāo)本采集

按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組(Sham group，SG=8只)、脊髓損傷組(Control group，CG=24只)和骶神經(jīng)電刺激組(Experimental group，EG=24只)。CG(24、48和72 h，8只/組)和EG (24、48和72 h，8只/組)。

1.3 腸粘膜形態(tài)學(xué)觀察

消毒后剖腹，取小腸組織(距離盲腸約10 cm)，常規(guī)處理后分別進(jìn)行光鏡和透射電鏡觀察。

1.4 Western blot檢測(cè)小腸組織中鋅指蛋白A20、NOD2和CD68蛋白表達(dá)量

Anti-鋅指蛋白A20、Anti-NOD2抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司， Anti-CD68抗體、Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，以β-actin 為內(nèi)參。用 image J 圖像分析軟件，根據(jù)光密度定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 腸道形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 光鏡 SG小腸黏膜完整、形態(tài)正常；CG黏膜形態(tài)破壞隨時(shí)間逐漸加重，24 h發(fā)現(xiàn)(Peyer patch，PP)濾泡相關(guān)上皮破壞，使腸腔和上皮下穹隆貫通；72 h黏膜下水腫、淤血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸絨毛破壞，上皮細(xì)胞壞死，大量滲出。EG黏膜形態(tài)也有不同程度破壞，72 h黏膜下血管輕度充血，少量滲出物，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

2.1.2 電鏡 SG細(xì)胞間緊密連接、中間連接和橋粒正常，小腸微絨毛排列整齊；CG黏膜上皮出現(xiàn)不同程度細(xì)胞水腫，細(xì)胞間隙增寬。72 h黏膜上皮細(xì)胞水腫嚴(yán)重，部分細(xì)胞壞死，細(xì)胞間隙明顯增寬,微絨毛水腫、折斷并脫落。部分腸黏膜上皮細(xì)胞崩解破裂，細(xì)胞外細(xì)菌和雜質(zhì)進(jìn)入腸黏膜上皮細(xì)胞;細(xì)胞外細(xì)菌和雜質(zhì)穿經(jīng)M細(xì)胞并同時(shí)沿細(xì)胞軸經(jīng)細(xì)胞旁緊密連接處進(jìn)入黏膜下組織;細(xì)菌進(jìn)入血管，和紅細(xì)胞共同在微血管內(nèi)循環(huán)。EG上述損傷較輕，72 h黏膜上皮細(xì)胞水腫，細(xì)胞間隙略增寬，微絨毛變疏松(圖2，3)。

Fig. 2 Intestinal morphology under transmission electron microscope in each group

Fig. 3 Electron microscopic observation of bacteria and impurities penetrating the intestinal mucosal barrier

2.2 腸組織鋅指蛋白A20、NOD2和CD68表達(dá)

鋅指蛋白A20：與SG相比，CG各小組A20表達(dá)均明顯降低(P<0.01)；與SG、CG相比，EG各小組A20的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。A20作為機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)調(diào)控的內(nèi)源性蛋白，其表達(dá)量增加，提示機(jī)體內(nèi)源性抗炎保護(hù)作用得到增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)CG組減少，提示SCI小腸缺少鋅指蛋白A20保護(hù)，SNS后明顯增加，說(shuō)明SNS可刺激鋅指蛋白A20產(chǎn)生，減少腸黏膜炎癥反應(yīng)、氧化反應(yīng)并提供內(nèi)源性保護(hù)。

NOD2：與SG比，CG各組NOD2的表達(dá)均明顯升高(24 h、72 hP<0.05；48 hP<0.01)；與CG比，EG 48 h、72 h NOD2的表達(dá)均明顯降低( 48 hP< 0.01,72 hP<0.05);與SG相比，EG各組NOD2表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NOD2蛋白作為一種細(xì)胞內(nèi)膜識(shí)別受體，可通過(guò)其下游靶基因表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮病原防御、抗炎作用。其表達(dá)量增加，提示機(jī)體有抗原入侵，發(fā)生炎癥反應(yīng)；SNS后NOD2表達(dá)下降接近SG水平，證明炎癥反應(yīng)減輕。

CD68：與SG、EG比，CG各組CD68的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)；與SG相比，EG 24 h、48 h組NOD2表達(dá)明顯升高(P<0.01),72 h組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD68蛋白作為一種巨噬細(xì)胞標(biāo)記性分子，其表達(dá)量增加，提示巨噬細(xì)胞數(shù)量增加并活躍，機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)；SNS后炎癥反應(yīng)減輕(圖4，表1)。

Fig. 4 The expressions of A20, NOD2, and CD68 in small intestine of EG, SG and CG

Tab. 1 The expression levels of A20, NOD2, and CD68 in small intestine

3 討論

腸道免疫系統(tǒng)主要由腸黏膜上皮的免疫相關(guān)組織(如PP、腸系膜淋巴結(jié))、細(xì)胞(如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及B細(xì)胞等)和分子(抗菌肽、免疫球蛋白、融酶等)組成，構(gòu)成免疫屏障，及時(shí)識(shí)別外來(lái)微生物抗原、食物抗原以及自身異常抗原，誘導(dǎo)出局部及全身免疫應(yīng)答反應(yīng),維持腸道動(dòng)態(tài)平衡[3]。小腸黏膜免疫屏障包括黏膜層及黏膜下固有層內(nèi)的局部淋巴細(xì)胞，構(gòu)成黏膜相關(guān)淋巴組織，結(jié)構(gòu)上分為免疫誘導(dǎo)部分和免疫效應(yīng)部分。比如位于黏膜誘導(dǎo)部位的M細(xì)胞[4]攝取抗原，呈遞給巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和肥大細(xì)胞[5]，這些細(xì)胞再對(duì)抗原進(jìn)行加工處理；或由上皮細(xì)胞呈遞給B細(xì)胞和T細(xì)胞。樹(shù)突狀細(xì)胞還可以打開(kāi)腸道上皮的緊密連接直接進(jìn)入腸腔吞噬病原體，激活黏膜免疫系統(tǒng)的幼稚T細(xì)胞。淋巴細(xì)胞和抗原發(fā)生作用后，呈遞抗原給腸道淋巴結(jié)，再進(jìn)入全身循環(huán)，然后再回到腸道，稱之為歸巢。免疫屏障功能的狀態(tài)關(guān)乎腸道局部和全身炎癥反應(yīng)的程度，也是本次研究的重點(diǎn)。

完整的腸上皮細(xì)胞選擇通透性能夠有效阻止細(xì)菌及內(nèi)毒素等有害物質(zhì)透過(guò)腸黏膜組織進(jìn)入血液。腸上皮細(xì)胞間通道是封閉的，這種生理功能是由相鄰上皮細(xì)胞之間的連接復(fù)合體完成的，其中緊密連接起著主要的作用。腸道蠕動(dòng)是腸道機(jī)械屏障的另一重要組成部分[6]。正常腸道菌群構(gòu)成腸道的非特異性免疫屏障,形成穩(wěn)態(tài)[7]。當(dāng)腸道細(xì)菌數(shù)量、種類或者位置發(fā)生變化時(shí)，腸道的穩(wěn)態(tài)發(fā)生破壞，腸道免疫系統(tǒng)就會(huì)啟動(dòng)來(lái)糾正以維持平衡[8,9]。腸道機(jī)械屏障一旦破壞，腸道通透性會(huì)增加[10]。腸黏膜上皮的完整性，也是微生物和免疫屏障之間的壁壘[11]。當(dāng)SCI時(shí)，腸道功能紊亂，蠕動(dòng)減慢，腸管積氣、積便，大量細(xì)菌繁殖。同時(shí)，可直接或間斷破壞腸道械屏障，細(xì)菌通過(guò)腸黏膜上皮細(xì)胞和其間的緊密連接組成機(jī)械屏障而進(jìn)入黏膜下組織[12]，腸黏膜上皮免疫相關(guān)組織就會(huì)發(fā)揮作用，形成激烈的局部炎癥反應(yīng)。尤其巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞等在PP上皮穹隆的下面，非常適合監(jiān)測(cè)進(jìn)入PP的微生物，導(dǎo)致大量的免疫細(xì)胞聚集并把細(xì)菌帶入循環(huán)系統(tǒng)。內(nèi)毒素再次打擊腸黏膜形成繼發(fā)性損傷，免疫屏障功能從而也遭到破壞，進(jìn)而形成惡性循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后腸道黏膜開(kāi)始出現(xiàn)黏膜下血管充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜上皮細(xì)胞輕度水腫，細(xì)胞間隙略增寬。24 h發(fā)現(xiàn)PP濾泡相關(guān)上皮破壞，使腸腔和上皮下穹隆貫通；后期甚至出現(xiàn)腸絨毛破壞，上皮細(xì)胞壞死，大量滲出。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CG72 h組黏膜上皮細(xì)胞水腫嚴(yán)重，部分細(xì)胞壞死，細(xì)胞間隙明顯增寬,微絨毛水腫、折斷并脫落。嚴(yán)重區(qū)域有細(xì)胞崩解破裂，細(xì)胞外細(xì)菌和雜質(zhì)進(jìn)入腸黏膜上皮細(xì)胞;細(xì)胞外細(xì)菌和雜質(zhì)穿經(jīng)M細(xì)胞并同時(shí)沿細(xì)胞軸經(jīng)細(xì)胞旁緊密連接處進(jìn)入黏膜下組織;細(xì)菌進(jìn)入血管，和紅細(xì)胞共同在微血管內(nèi)循環(huán)。而EG組雖然也有不同程度損傷，但較對(duì)照組明顯減輕。

巨噬細(xì)胞在維持腸黏膜免疫平衡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[13]。巨噬細(xì)胞標(biāo)記性分子CD68可用于檢測(cè)巨噬細(xì)胞的分布規(guī)律和數(shù)量[14]。CD68可激活體內(nèi)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，造成NF-KB等活化，啟動(dòng)多種炎癥細(xì)胞因子基因(如IL-1b, TNF, IL-12, and IL-23等)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，加強(qiáng)體內(nèi)炎癥反應(yīng)[15]。本實(shí)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)：與SG、EG比，CG各組CD68的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)；與SG相比，EG24h、48h組NOD2表達(dá)明顯升高(P<0.01),72 h組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，比較活躍，黏膜局部發(fā)生明顯的炎癥反應(yīng)[16]。EG各組CD68的表達(dá)均減少，到72 h組減少到和SG組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明SNS后，黏膜下炎癥反應(yīng)減輕。

鋅指蛋白A20是炎癥時(shí)NF-KB活化介導(dǎo)并自體合成的一種強(qiáng)有效抑制NF-KB的炎癥反應(yīng)特異性調(diào)控蛋白[17]，降低炎癥介質(zhì)(TNF-α、IL-β等) 釋放，調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)和凋亡抑制,通過(guò)抗炎癥反應(yīng)和抗氧化反應(yīng)，維持機(jī)體免疫能力以達(dá)到機(jī)能平衡[18]；同時(shí)調(diào)整多核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以提高內(nèi)在免疫功能[19]。創(chuàng)傷感染的早期A20表達(dá)增加是機(jī)體重要的內(nèi)源性抗炎保護(hù)效應(yīng)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與SG相比，CG各小組A20表達(dá)均明顯降低(P<0.01)；與SG、CG相比，EG各小組A20的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。A20作為機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)調(diào)控的內(nèi)源性蛋白，其表達(dá)量增加，提示機(jī)體內(nèi)源性抗炎保護(hù)作用得到增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)CG組減少，提示SCI小腸缺少鋅指蛋白A20保護(hù)，SNS后明顯增加，說(shuō)明SNS可刺激鋅指蛋白A20產(chǎn)生，減少腸黏膜炎癥反應(yīng)、氧化反應(yīng)并提供內(nèi)源性保護(hù)。

NOD2是凋亡調(diào)節(jié)因子，NOD2突變，改變了NF-κB的信號(hào)反應(yīng)，導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生。NOD2蛋白是一種細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體，可識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖及其裂解產(chǎn)物胞壁酰二肽，廣泛參與宿主對(duì)病原體的免疫應(yīng)答，是聯(lián)系天然免疫與特異性免疫的重要橋梁。NOD2在腸道上皮細(xì)胞中的表達(dá)較低，可能是機(jī)體對(duì)腸道正常微生物的一種保護(hù)機(jī)制[20]。外源微生物入侵時(shí)，機(jī)體可能通過(guò)其它模式識(shí)別受體激活NF-κB，上調(diào)NOD2的表達(dá)，啟動(dòng)其介導(dǎo)的信號(hào)通路。正常情況下，NOD2可通過(guò)其下游靶基因表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮病原防御、抗炎作用。如NOD2的下游靶目標(biāo)黏膜免疫排斥因子DMBT1，可防止細(xì)菌侵入小腸上皮細(xì)胞。NOD2也可通過(guò)調(diào)控腸道Paneth細(xì)胞釋放防御素和抗菌肽來(lái)維持腸道黏膜正常的屏障功能[21]，或者與CD147形成CD147-NOD2復(fù)合物降低CD147的活性，因?yàn)镃D147高表達(dá)會(huì)促進(jìn)李斯特菌侵入上皮細(xì)胞。NOD2基因突變或功能缺陷導(dǎo)致腸道對(duì)病原體容忍度增加[22]，因此，腸道免疫屏障受損。可能是由于抗菌肽表達(dá)量減少、防御素表達(dá)缺乏調(diào)節(jié)、腸黏膜滲透性增加等原因，使得腸道殺菌能力減弱、細(xì)菌易于侵入上皮細(xì)胞。本實(shí)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)：與SG比，CG各組NOD2的表達(dá)均升高(24 h、72 hP<0.05；48 hP< 0.01)；與CG比，EG48 h、72 h NOD2的表達(dá)均降低(48 hP<0.01,72 hP<0.05);與SG相比，EG各組NOD2表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NOD2蛋白作為一種細(xì)胞內(nèi)膜識(shí)別受體，可通過(guò)其下游靶基因表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮病原防御、抗炎作用。其表達(dá)量增加，提示機(jī)體有抗原入侵，發(fā)生炎癥反應(yīng)；SNS后NOD2表達(dá)下降接近SG水平，證明炎癥反應(yīng)減輕。

總之，SNS能較好促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，保護(hù)腸黏膜機(jī)械屏障，減少病原體入侵，減輕炎癥反應(yīng)并加強(qiáng)內(nèi)源性保護(hù)，改善腸黏膜免疫屏障功能。為改善腸道功能，預(yù)防截癱后內(nèi)毒素血癥和腸道菌群移位感染的發(fā)生提供了一種有效的選擇。