高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定牙痛藥水中丁香酚和胡椒堿含量*

黃 華，許鶯婷，胡衛(wèi)南，余小平

（浙江省衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 衢州 324002）

牙痛藥水收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第二冊(cè)）》（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為WS3-B-2009-90），由蓽茇、高良姜、細(xì)辛、丁香、冰片組方，前3 味藥經(jīng)60%乙醇加熱回流提取，丁香用乙醇提取，合并后加甘油混合，加冰片混勻，有止痛、殺菌、防蛀作用，主要用于風(fēng)火牙痛、牙齦紅腫、蟲蛀牙痛及一切神經(jīng)牙痛。蓽茇為方中君藥，含胡椒堿，丁香中含丁香酚，為本制劑的有效成分，原標(biāo)準(zhǔn)中只測(cè)定乙醇量，有效成分測(cè)定均未涉及。液相法分別測(cè)定牙痛藥水中胡椒堿含量已有報(bào)道，但通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)查詢，同時(shí)測(cè)定丁香酚和胡椒堿含量國(guó)內(nèi)目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究中查閱文獻(xiàn)[1-11]，建立了同時(shí)測(cè)定丁香酚和胡椒堿含量的高效液相色譜（HPLC）法。現(xiàn)報(bào)道如下。

圖1 高效液相色譜圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司），包括真空脫氣機(jī)（G1322A），四元泵（G1311A），自動(dòng)進(jìn)樣器（G1329A），柱溫箱（G1316A），二極管陣列檢測(cè) 器 （DAD）（G1315D），Agilent 色譜工作站（Rev.B.03.02 January，2008）；Mettler AE 240 型電子天平（梅特勒公司，精密度為0.01 mg）；KQ-250B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，250 W，40 kHz）；UV2450 型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 試藥

甲醇為分析純；水為純化水；丁香酚對(duì)照品（批號(hào)110725-201615，含量為99.3%），胡椒堿對(duì)照品（批號(hào)110775-201104，含量為99.2%），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；牙痛藥水[市購(gòu)3 批，規(guī)格均為每瓶5 mL（批號(hào)為170802，成都迪康制藥有限公司；批號(hào)為170501，廣西慧寶源制藥有限公司；批號(hào)為G17034，包頭中藥有限責(zé)任公司）]；高良姜、細(xì)辛、冰片本地市購(gòu)，經(jīng)我院宋劍鋒主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire- C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（72∶28，V/ V）；流速：1.0mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)器：DAD 檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：分別取丁香酚對(duì)照品25 mg、胡椒堿對(duì)照品12 mg，精密稱定，置同一50 mL 容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取5 mL，置同一25 mL 容量瓶中，甲醇至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取本品5 支，混勻，精密量取2 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理10 min，冷至室溫，在加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中處方比例、制法制備不含蓽茇、丁香的陰性樣品溶液，按供試品溶液制備方法制得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取上述3 種溶液，按擬訂色譜條件，分別進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，丁香酚的保留時(shí)間（t）為3.5 min，胡椒堿的保留時(shí)間（t）為5.4 min，陰性對(duì)照品溶液在丁香酚、胡椒堿出峰時(shí)間區(qū)域無(wú)干擾峰出現(xiàn)，故對(duì)丁香酚、胡椒堿的測(cè)定無(wú)干擾作用。理論板數(shù)以丁香酚計(jì)可達(dá)8 000 以上，樣品中丁香酚、胡椒堿與相鄰色譜峰的分離度滿足測(cè)定要求。

線性關(guān)系考察：分別精密量取對(duì)照品貯備液1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0 mL，分別置20 mL 容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以丁香酚、胡椒堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y丁=5.007X+2.721 9，r=0.999 6（n=6）和Y胡=12.858X+7.101 4，r=1.000 0（n=6）。結(jié)果表明，丁香酚和胡椒堿質(zhì)量濃度在25.4 ～279.8 μg/mL 和12.5 ～137.8 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，以峰面積和保留時(shí)間考察進(jìn)樣精密度。結(jié)果丁香酚、胡椒堿的峰面積值基本不變，RSD分別為1.45%和0.12%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別于0，2，4，6，8，20，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果丁香酚、胡椒堿峰面積的RSD分別為0.73%和1.06%（n=7），表明供試品溶液在常溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為170802），分別按2.2項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液和混合對(duì)照品溶液，分別精密量取5 μL 注入液相色譜儀，以外標(biāo)法分別計(jì)算含量。結(jié)果丁香酚、胡椒堿平均含量分別為1.439 mg/mL和0.632 mg/mL，RSD分別為0.69%和0.84%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取陰性樣品溶液9 份，每份2 mL，分別置25 mL 容量瓶中，再分別精密加入對(duì)照品貯備液4.0，5.0，6.0 mL 各3 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試液品和對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算丁香酚、胡椒堿的回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（ n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，按

擬訂色譜條件各精密量取5 μL 注入液相色譜儀，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定（n=3）

3 討論

3.1 測(cè)定指標(biāo)確定[1]

牙痛水中蓽茇為君藥，蓽茇被收載在2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》，含量測(cè)定指標(biāo)為胡椒堿；處方中丁香也為2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》收載品種，含量測(cè)定指標(biāo)為丁香酚，故本研究中將胡椒堿和丁香酚確定為牙痛水中含量測(cè)定指標(biāo)。

3.2 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

紫外最大吸收波長(zhǎng)丁香酚為280 nm，胡椒堿為343 nm，丁香酚在343 nm 波長(zhǎng)處幾乎無(wú)吸收，胡椒堿在280 nm 波長(zhǎng)處有吸收。綜合考慮，選擇280 nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相選擇

本研究中選用不同比例的甲醇水作為流動(dòng)相，水比例提高，主峰出峰推遲，胡椒堿峰變寬，對(duì)稱度變差。最終選擇甲醇-水（72 ∶28，V/ V）為測(cè)定條件，此條件下陰性對(duì)照品溶液在丁香酚、胡椒堿出峰時(shí)間區(qū)域無(wú)干擾峰出現(xiàn)，對(duì)結(jié)果影響較小。水相pH 調(diào)高調(diào)低，對(duì)主峰出峰時(shí)間無(wú)影響。

3.4 樣品測(cè)定濃度確定

樣品濃度以2 mL 稀釋至25 mL 較合理，濃度太高雜質(zhì)對(duì)測(cè)定有干擾，易造成含量偏高。