圈養(yǎng)大熊貓所食蘋果和胡蘿卜的氣味特點(diǎn)與香氣成分研究

鮮義坤，楊 楠，孔 凌，李裕冬，劉張育，陳緒玲，鄧 虹，熊鐵一*

（1.四川省自然資源科學(xué)研究院，成都 610041；2.成都大帝漢克生物科技有限公司，成都 611130）

在人工飼養(yǎng)條件下每天都要喂給亞成年和成年大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）一定數(shù)量的水果類食物——蘋果和蔬菜類食物——胡蘿卜[1-2]，以補(bǔ)充維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，保障大熊貓身體健康和快樂生活。野生大熊貓對(duì)竹子具有明顯的選擇性采食[3-4]，圈養(yǎng)大熊貓對(duì)不同種類的水果也呈現(xiàn)不同的采食選擇傾向，對(duì)有些水果供試大熊貓都不采食，對(duì)有些水果有的個(gè)體采食而有的個(gè)體不采食[5]，但對(duì)蘋果卻普遍表現(xiàn)出非常喜歡采食，此外對(duì)胡蘿卜也喜歡采食。除采食習(xí)慣外圈養(yǎng)大熊貓為什么喜食蘋果和胡蘿卜？這2種果蔬類食物對(duì)圈養(yǎng)大熊貓來說是否存在氣味方面的誘食機(jī)制？本文試圖揭開圈養(yǎng)大熊貓優(yōu)先選擇蘋果和胡蘿卜采食的氣味之秘。

國內(nèi)外對(duì)蘋果氣味物質(zhì)的研究已有半個(gè)多世紀(jì)之久，通過多種不同的分析方法，共鑒定出300余種揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs），不同的分析方法、品種、產(chǎn)地、栽培管理水平、采收時(shí)期、貯藏條件和時(shí)間等均有不同的成分測(cè)定結(jié)果，但與特征性香氣有關(guān)的物質(zhì)只有20～40 種[6-7]，這方面的文獻(xiàn)較多[6-15]；而對(duì)胡蘿卜氣味物質(zhì)研究的報(bào)道較少[16-22]；均從人的喜食風(fēng)味偏好和市場(chǎng)購買意愿角度去研究以便加工改善或育種改良，但未從大熊貓喜食氣味機(jī)理角度來分析這2種果蔬類食物的氣味及其成分。鹽源縣隸屬四川省涼山彝族自治州，地處青藏高原東南緣，享有亞熱帶季風(fēng)氣候，日照時(shí)間較長，所產(chǎn)蘋果個(gè)小味甜，未檢索出鹽源蘋果氣味成分的專門研究報(bào)道。頂空（HS）—固相微萃取（SPME）—?dú)庀嗌V（GC）—質(zhì)譜（MS）聯(lián)用分析技術(shù)可直接檢測(cè)樣品散發(fā)出的揮發(fā)性有機(jī)物，能真實(shí)、準(zhǔn)確地反映樣品的氣味物質(zhì)種類及其濃度，成為當(dāng)今世界測(cè)定樣品中未知?dú)馕冻煞值闹髁鞣椒?。本文通過專業(yè)人員的嗅感品評(píng)和HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法研究蘋果和胡蘿卜的氣味特點(diǎn)與香氣成分，旨在探尋大熊貓喜歡的食物氣味及其物質(zhì)，進(jìn)而探討大熊貓喜歡選擇這2種果蔬類食物采食的氣味機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

供試大熊貓2 只，1 只為春俏（雌性），譜系號(hào)968，生于2015年8月8日，采樣時(shí)年齡3歲；另1只為冰晶（雌性），譜系號(hào)943，生于2014年9月29日，采樣時(shí)年齡4 歲；均屬亞成體[1-2]，飼養(yǎng)于四川省峨眉山市仙芝竹尖生態(tài)園熊貓館，健康狀況良好，自由采食、飲水，圈內(nèi)隨意活動(dòng)。按照規(guī)定的人工飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行日常飼喂和管理，每天喂給大熊貓600～800 g蘋果和胡蘿卜。

1.2 供試材料

①蘋果：產(chǎn)于四川省鹽源縣，人工栽培，屬富士品種，外觀顏色幾乎為暗紅色，即富士紅蘋果（以下簡稱蘋果），新鮮，果形較好，單果重為150～200 g。②胡蘿卜：產(chǎn)地不詳，人工種植，外觀顏色為橙黃色，即橙色胡蘿卜（以下簡稱胡蘿卜），新鮮，外形好，單個(gè)重為300～400 g。蘋果和胡蘿卜均購自四川省峨眉山市城區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.3 樣品采集與制備方法

通過大熊貓的飼喂試驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)隨機(jī)取樣。蘋果和胡蘿卜先用流水清洗，去泥等異物，均未去皮，蘋果也未去果核，可體現(xiàn)大熊貓聞嗅蘋果和胡蘿卜的真實(shí)氣味。蘋果、胡蘿卜各任取1 個(gè)（根），一分為四，隨機(jī)取出3塊喂給大熊貓，當(dāng)這3 塊果蔬都分別被大熊貓全部吃完后另外1 塊才用作樣品，即所采樣品可代表大熊貓所食的果蔬。如此獲得的一些果蔬樣品先切成細(xì)條狀，再切成顆粒狀，混合，隨機(jī)取出用于VOCs 分析或氣味品評(píng)的樣品，制好的樣品密封保存于-20 ℃的冰箱中待測(cè)評(píng)。采集的大樣和備好的小樣分別在裝有冰袋的保溫箱和保溫桶中運(yùn)輸。在樣品采集和制備之前所有與樣品接觸的用具用品須經(jīng)反復(fù)清洗，達(dá)到干凈無味，以防其他氣味串入樣品。

1.4 氣味品評(píng)方法

供評(píng)樣品稱重2.0 g，與大熊貓所食其他食物一起編號(hào)，由6名專業(yè)品評(píng)人員在不知曉食物名稱的情況下盲評(píng)。具體方法參見文獻(xiàn)[23]。

1.5 HS-SPME-GC-MS方法

1.5.1 儀器設(shè)備

Agilent 7890B-5977B 型GC-MS 聯(lián)用儀；HPINNOWax 型超高惰性石英毛細(xì)管色譜柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；20 mL頂空瓶及其相應(yīng)的密封墊和鋁蓋；均由美國Agilent 公司出品。75 μm CAR/PDMS型SPME纖維頭和SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄均由美國Supelco 公司出品。其他器材和用品均為測(cè)試分析室常規(guī)配置。

1.5.2 HS-SPME方法

在70 ℃的條件下頂空萃取1 h。具體方法參見文獻(xiàn)[23]。

1.5.3 GC-MS方法

GC 條件：進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為高純氦氣，柱流量為0.80 mL · min-1，進(jìn)樣模式為分流，分流比為5∶1。程序升溫模式：起始溫度45℃，保持3 min，以5 ℃·min-1速率升至180℃，再以8 ℃·min-1速率升至260·℃，保持10 min。MS 條件及其數(shù)據(jù)處理：同文獻(xiàn)[24]的測(cè)試方法二。

1.6 香氣成分的判定標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法測(cè)定的大多數(shù)VOCs 均有不同類型和不同強(qiáng)度的氣味，但有些氣味物質(zhì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體可產(chǎn)生不利甚至有害的影響。本文的香氣成分僅限于我國、歐盟、美國、日本的法規(guī)允許在加工類食品中添加使用，且在市場(chǎng)上可流通交易的單體呈香物質(zhì)，并非所有的揮發(fā)性有機(jī)物或氣味成分。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)從已測(cè)定的VOCs 中選出食品級(jí)的香氣物質(zhì)，便于研制大熊貓專用誘食劑時(shí)參考與應(yīng)用。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣味的嗅感品評(píng)

2.1.1 蘋果氣味的嗅感品評(píng)

整體上香氣濃郁、寬厚、圓潤、新鮮、透發(fā)，擴(kuò)散性較強(qiáng)，愉悅度較高。屬水果香型[25]中的紅蘋果氣味，清香飄溢，甜氣明顯，略帶酒香和木香韻調(diào)，有人聞出微弱的酸香氣息。

2.1.2 胡蘿卜氣味的嗅感品評(píng)

整體上香氣強(qiáng)度較弱，愉悅度尚可。屬新鮮、成熟的胡蘿卜氣味，甜香和清香相對(duì)突出，稍有木香和壤香韻調(diào)，有人聞出微弱的油脂氣息。

2.2 VOCs和香氣成分

2.2.1 蘋果的VOCs和香氣成分

圖1 圈養(yǎng)大熊貓所食蘋果的VOCs總離子流色譜

表1 圈養(yǎng)大熊貓所食蘋果的VOCs

續(xù)表

蘋果的VOCs：見圖1和表1。

從表1可知，蘋果中可確定（匹配度≥80%，下同）的VOCs 有72 種，各自歸屬于有機(jī)化合物的類別見表2。

由表2 可知，蘋果中的VOCs 有9 類化合物。無論成分?jǐn)?shù)量還是相對(duì)含量，酯類、烯烴類及醇類均為排在前3 位的類別，這3 類VOCs 成分?jǐn)?shù)累計(jì)達(dá)59 種，占VOCs 成分總數(shù)的81.94%，相對(duì)含量累計(jì)達(dá)92.35%，說明酯類、烯烴類及醇類是蘋果的3 大主要有機(jī)化合物類別，其中最主要的VOCs是酯類，與文獻(xiàn)[6-8,10-15]一致。

蘋果的香氣成分：詳見表1 中帶※號(hào)的成分。由表1和表2可知，蘋果中可確定的香氣成分有55種，占VOCs總數(shù)的76.39%，各自歸屬于有機(jī)化合物的類別見表2。由表2 可知，蘋果中的香氣成分有8類化合物。就成分?jǐn)?shù)量而言，酯類、醇類及烯烴類是排在前3位的類別，累計(jì)達(dá)47種，占香氣成分總數(shù)的85.45%；而在相對(duì)含量方面，則酯類、烯烴類及醇類是排在前3 位的類別，累計(jì)達(dá)89.94%，可見這3類香氣成分是蘋果氣味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)種類，對(duì)蘋果多種氣味的形成可能起到主要或主導(dǎo)作用。相對(duì)含量排在前10 位的單一香氣成分由高到低依次為α-金合歡烯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸己酯、乙酸順式-2-己烯酯、丁酸己酯、乙酸丁酯、1-己醇、己酸丁酯、辛酸丁酯，這10 種香氣成分歸類為酯8種（相對(duì)含量小計(jì)47.33%）、烯烴1 種（相對(duì)含量為26.51%）、醇1 種（相對(duì)含量為2.94%），相對(duì)含量累計(jì)達(dá)76.78%，對(duì)蘋果主要?dú)馕都捌鋸?qiáng)度可能起到重大作用。

表2 蘋果中VOCs和香氣成分的歸類與相對(duì)含量統(tǒng)計(jì)

2.2.2 胡蘿卜的VOCs和香氣成分

圖2 圈養(yǎng)大熊貓所食胡蘿卜的VOCs總離子流色譜

胡蘿卜的VOCs：見圖2 和表3。從表3 可知，胡蘿卜可確定（匹配度≥80%）的VOCs 有47 種，各自歸屬于有機(jī)化合物的類別見表4。

表3 圈養(yǎng)大熊貓所食胡蘿卜的VOCs

續(xù)表

表4 胡蘿卜中VOCs的分類與相對(duì)含量統(tǒng)計(jì)

由表4 可知，胡蘿卜中的VOCs 有9 類化合物。就成分?jǐn)?shù)量而言，烯烴類、酯類及芳烴類和醇類（并列）是排在前3 位的類別，按3 類VOCs 數(shù)量累計(jì)，有38種，占VOCs成分總數(shù)的80.85%。若按相對(duì)含量排序，烯烴類、芳烴類及醇類是排在前3位的類別，累計(jì)達(dá)97.66%，說明烯烴類、芳烴類及醇類是胡蘿卜的3大主要有機(jī)化合物類別，其中最主要的VOCs是烯烴類，其次是芳烴類。

胡蘿卜的香氣成分：詳見表3 中帶※號(hào)的成分。由表3 和表4 可知，胡蘿卜中可確定的香氣成分有26 種，占VOCs 總數(shù)的55.32%，各自歸屬于有機(jī)化合物的類別見表2。由表2 可知，胡蘿卜中的香氣成分有6類化合物。就成分?jǐn)?shù)量而言，烯烴類、酯類及芳烴類和酮類（并列）是排在前3位的類別,按3類VOCs數(shù)量累計(jì)，為22種，占香氣成分總數(shù)的84.62%；而在相對(duì)含量方面，則是烯烴類、芳烴類及醇類是排在前3 位的類別，累計(jì)達(dá)82.81%，可見烯烴類和芳烴類這2大類香氣成分是胡蘿卜氣味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)種類，對(duì)胡蘿卜多種氣味的形成可起到主要或主導(dǎo)作用。相對(duì)含量排在前10 位的單一香氣成分由高到低依次為β-石竹烯、對(duì)傘花烴、γ-松油烯、異松油烯、a-蒎烯、d-檸檬烯、β-月桂烯、乙醇、β-蒎烯、α-松油烯，這10 種香氣成分歸類為烯烴8 種（相對(duì)含量小計(jì)58.22%）、芳烴1 種（相對(duì)含量為20.25%）、醇1 種（相對(duì)含量為1.71%），相對(duì)含量累計(jì)達(dá)80.18%，對(duì)胡蘿卜主要?dú)馕都捌鋸?qiáng)度可能起到重大作用。

由上述可知，圈養(yǎng)大熊貓喜食果蔬類食物的氣味物質(zhì)類別較為寬泛，共有醇類、醛類、酮類、羧酸類、酯類、烯烴類、芳烴類、雜環(huán)類等8類，其中主要是酯類、烯烴類、醇類、芳烴類。

3 討論

3.1 圈養(yǎng)大熊貓所食蘋果和胡蘿卜氣味形成的物質(zhì)基礎(chǔ)

依據(jù)文獻(xiàn)[26-27]對(duì)具有FEMA編號(hào)的單體呈香物質(zhì)氣味特征記載，如：己酸乙酯的氣味特征為甜的、清香、水果、菠蘿、蘋果、脂肪、奶制品香氣。從表1 和表3 中可分別找到可能引起蘋果和胡蘿卜多種氣味的一些香氣成分。

蘋果的水果香氣味可能與乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、己醛、乙酸-2-甲基丁酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸乙酯、乙酸己酯、丙酸己酯、異丁酸己酯、1-己醇、乙酸庚酯、丙酸反式-2-己烯酯、反式-2-己烯-1-醇、己酸丁酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯、辛酸乙酯、異丁酸順式-3-己烯酯、丁酸反式-2-己烯酯、2-甲基丁酸反式-2-己烯酯、己酸戊酯、己酸己酯、辛酸己酯（以表1 中出現(xiàn)的先后為序，下同）等26種香氣成分有關(guān)。清香氣味可能與2-甲基丁酸乙酯、己醛、2-甲基-1-丁醇、反式-2-己烯醛、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸葉醇酯、異丁酸己酯、1-己醇、乙酸庚酯、反式-2-己烯-1-醇、己酸丁酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯、1-庚醇、己酸戊酯、1-辛醇、己酸己酯、順式-β-金合歡烯、α-金合歡烯、順式、反式-α-金合歡烯、辛酸己酯等22 種香氣成分有關(guān)。甜香氣味可能與乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸-2-甲基丁酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸乙酯、乙酸己酯、異丁酸己酯、1-己醇、辛酸乙酯、己酸戊酯、1-辛醇、己酸己酯、水楊酸甲酯等15 種香氣成分有關(guān)。酒香氣味可能與乙酸乙酯、乙醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、1-己醇、辛酸乙酯、1-庚醇、己酸戊酯等8種香氣成分有關(guān)。木香氣味可能與己醛、乙酸庚酯、2-甲基丁酸己酯、β-石竹烯、順式-β-金合歡烯、α-金合歡烯、順式，反式-α-金合歡烯等7 種香氣成分有關(guān)。酸香可能與丙酸己酯等香氣成分有關(guān)。蘋果的獨(dú)特氣味可能與戊酸乙酯、反式-2-己烯醛、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸葉醇酯、異丁酸己酯、己酸丁酯、辛酸己酯等8種香氣成分有關(guān)。

胡蘿卜的水果香氣味可能與β-月桂烯、γ-松油烯、β-羅勒烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、丁酸己酯、己酸己酯、2-甲基丁酸、β-紅沒藥烯、順式-α-紅沒藥烯、反式-γ-紅沒藥烯、α-紅沒藥烯、香葉基丙酮、異戊酸芳樟酯（以表2 中出現(xiàn)的先后為序，下同）等13種香氣成分有關(guān)。清香氣味可能與β-月桂烯、β-羅勒烯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、丁酸己酯、己酸己酯、β-紅沒藥烯、順式-α-紅沒藥烯、反式-γ-紅沒藥烯、α-紅沒藥烯、香葉基丙酮等10 種香氣成分有關(guān)。甜香氣味可能與d-檸檬烯、β-羅勒烯、己酸己酯、水楊酸甲酯等4種香氣成分有關(guān)。木香氣味可能與a-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、β-羅勒烯、異松油烯、乙酸冰片酯、β-石竹烯、β-紅沒藥烯、順式-α-紅沒藥烯、反式-γ-紅沒藥烯、α-紅沒藥烯、香葉基丙酮、氧化石竹烯等14 種香氣成分有關(guān)。壤香可能與莰烯等香氣成分有關(guān)。油脂氣息可能與6-甲基-5-庚烯-2-酮等香氣成分有關(guān)。胡蘿卜特殊的氣味可能與相對(duì)含量排名第二的對(duì)傘花烴等香氣成分有關(guān)。

總之，蘋果和胡蘿卜的某種氣味并非由一種香氣成分引起，而是由多種香氣成分相互作用（協(xié)同增效或抵消減弱）后的結(jié)果[28]。

3.2 圈養(yǎng)大熊貓喜歡的食物氣味

通過對(duì)圈養(yǎng)大熊貓采食行為的仔細(xì)觀察，圈養(yǎng)大熊貓喜食蘋果和胡蘿卜。結(jié)合上述氣味成分剖析，作者認(rèn)為圈養(yǎng)大熊貓喜歡食物的綜合性氣味有水果香氣味、蘋果氣味、胡蘿卜氣味等，就單一香型氣味而言有清香氣味、甜香氣味等，這些氣味是誘導(dǎo)圈養(yǎng)大熊貓采食蘋果和胡蘿卜的主要?dú)馕?，可能因?yàn)槿︷B(yǎng)大熊貓熟悉這些氣味并認(rèn)知它們是安全的，為自然選擇和長期進(jìn)化所致。在食物供給充足的人工飼養(yǎng)條件下，食物的氣味是決定圈養(yǎng)大熊貓優(yōu)先選擇采食的首要食物因素，當(dāng)然圈養(yǎng)大熊貓喜食蘋果和胡蘿卜還可能與采食習(xí)慣、蘋果和胡蘿卜的適口性（包括味道和質(zhì)構(gòu)等）以及營養(yǎng)性等有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過專業(yè)人員的嗅感品評(píng)，圈養(yǎng)大熊貓所食蘋果的香氣濃郁，擴(kuò)散性較強(qiáng)，愉悅度較高，氣味屬水果香型中的紅蘋果氣味，清香飄溢，甜氣明顯，略帶酒香和木香；圈養(yǎng)大熊貓所食胡蘿卜的香氣強(qiáng)度較弱，愉悅度尚可，氣味屬新鮮、成熟的橙色胡蘿卜氣味，甜香和清香相對(duì)突出，稍有木香和壤香。經(jīng)HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用法測(cè)定，從蘋果中共測(cè)出55 種香氣成分，可歸類為醇8 種、醛3 種、酮1 種、羧酸2 種、酯35 種、烯烴4 種、芳烴1種、雜環(huán)化合物1種，相對(duì)含量較高的香氣成分為α-金合歡烯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸己酯、乙酸順式-2-己烯酯、丁酸己酯、乙酸丁酯、1-己醇、己酸丁酯、辛酸丁酯，可見酯類、烯烴類及醇類是蘋果氣味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)種類；從胡蘿卜中共測(cè)出26種香氣成分，可歸類為醇1種、酮2 種、羧酸1 種、酯6 種、烯烴14 種、芳烴2種，相對(duì)含量較高的香氣成分為β-石竹烯、對(duì)傘花烴、γ-松油烯、異松油烯、α-蒎烯、d-檸檬烯、β-月桂烯、乙醇、β-蒎烯、α-松油烯，可見烯烴類和芳烴類是胡蘿卜氣味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)種類。

致謝：西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院的包清彬教授、成都大帝漢克生物科技有限公司的李松柏高級(jí)工程師、黃明亞工程師、趙仁仟同志參加了香氣品評(píng)以及喻麟董事長和李小兵總經(jīng)理給予了支持,四川省峨眉山市仙芝竹尖生態(tài)園熊貓館原館長吳永中等同事在飼喂試驗(yàn)和采樣時(shí)積極配合，中國科學(xué)院成都分院分析測(cè)試中心的胡靜副研究員在揮發(fā)性成分分析與推定方面提供了幫助，在此一并深表謝意！