圍墾植稻對(duì)崇明東灘濕地產(chǎn)甲烷微生物的影響

張?chǎng)卫冢吴?，?潔，汪方圓，張耀鴻，賈仲君

由溫室氣體甲烷（CH4）增加導(dǎo)致的全球氣候變暖是當(dāng)前威脅人類生存和發(fā)展的環(huán)境問(wèn)題之一。根據(jù)IPCC的評(píng)估報(bào)告，大氣CH4濃度已達(dá)到近百年來(lái)的最高水平[1]，對(duì)全球氣候變暖的增溫貢獻(xiàn)已達(dá)15%[2-3]。濱海濕地是介于海洋與陸地之間的一種特殊生態(tài)系統(tǒng)[4]。研究表明，濱海濕地CH4排放量占到全球海洋CH4排放總量的20%～39%[5]。因此，研究濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)CH4排放特征及其影響要素不僅可以深入了解濕地碳循環(huán)的生物地球化學(xué)行為，還可為合理預(yù)測(cè)全球氣候變化提供重要科學(xué)依據(jù)[6]。

崇明島東灘是中國(guó)長(zhǎng)江口規(guī)模最大、發(fā)育最完善的河口型灘涂濕地，強(qiáng)烈受到人類活動(dòng)的影響[7]。隨著區(qū)域經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類對(duì)土地的需求越來(lái)越迫切，灘涂圍墾改農(nóng)田成為解決土地問(wèn)題的有效途徑[8]。圍墾后的濕地不再受潮汐影響，與近海間的物質(zhì)能量交換基本消失。隨后的農(nóng)作物種植、翻耕、施肥等農(nóng)業(yè)管理措施，使圍墾區(qū)生境發(fā)生顯著變化[6]，形成了獨(dú)特的濕地類型——圍墾區(qū)稻田濕地，與海堤以外的自然灘涂濕地形成了明顯的差別[9]。這種土地利用變化改變了土壤生物地球化學(xué)過(guò)程[10-11]，對(duì)土壤CH4產(chǎn)生過(guò)程會(huì)造成深刻的影響。已有研究表明，圍墾稻田的甲烷排放通量與濱海灘涂濕地[12]、內(nèi)陸淡水稻田[13]存在著明顯的差異。對(duì)其與環(huán)境要素之間的相互關(guān)系已進(jìn)行了一些初步研究[12]，但是從功能微生物角度，尤其是結(jié)合分子生物學(xué)方法探索該區(qū)域中甲烷產(chǎn)生過(guò)程的微生物機(jī)理的研究報(bào)道較少。

盡管自然界中產(chǎn)甲烷菌分布十分廣泛，但是僅能以乙酸、甲酸、H2/CO2、甲醇、甲硫醇類和甲胺類等C1甲基化合物作為產(chǎn)甲烷的底物[14]。根據(jù)其利用底物特點(diǎn)可將產(chǎn)甲烷菌分為H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型、乙酸營(yíng)養(yǎng)型和甲基類營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌。受到植被、土壤性質(zhì)、底物類型和硫酸鹽含量等環(huán)境因素影響，不同類型濱海濕地之間產(chǎn)甲烷菌種類和產(chǎn)甲烷途徑存在著很大的變異性[15-18]。那么，圍墾改稻田后土壤中各類營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的種類如何變化，其對(duì)甲烷產(chǎn)生過(guò)程的相對(duì)貢獻(xiàn)如何？這些問(wèn)題的探索對(duì)于深入了解圍墾區(qū)稻田甲烷排放通量至關(guān)重要。

基于此，本試驗(yàn)選取長(zhǎng)江口崇明島東灘自然灘涂濕地和圍墾區(qū)稻田為研究對(duì)象，以空間代替時(shí)間變化的方法，研究不同圍墾年限情景下土壤產(chǎn)甲烷速率的空間變異特征，分析功能微生物的群落及數(shù)量特征，探索其與產(chǎn)甲烷速率之間的相互關(guān)系，從而合理評(píng)估圍墾這一典型的人類干擾方式對(duì)區(qū)域甲烷排放通量的影響，以期為合理評(píng)價(jià)我國(guó)東部沿海地區(qū)圍墾造田的生態(tài)效應(yīng)提供理論指導(dǎo)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

本研究采樣地點(diǎn)為上海市崇明島東灘自然濕地和圍墾區(qū)稻田（121°09'～121°54'E，31°27'～31°51'N），該區(qū)域?qū)儆诘湫偷膩啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，終年溫?zé)幔邓渑?，年均?5.3℃，年降水量1 003.7 mm。在東灘濕地保護(hù)區(qū)中，選取低灘位的裸地光灘濕地（BF）和高灘位生長(zhǎng)蘆葦植被的蘆葦濕地（PA），作為圍墾0年的樣點(diǎn)。在圍墾區(qū)內(nèi)選取種稻27、51、86年的稻田（分別記為W-27、W-51、W-86）作為不同圍墾年限的稻田樣點(diǎn)。圍墾植稻不同年限的試驗(yàn)樣點(diǎn)根據(jù)Cui等[19]的參考文獻(xiàn)選取。為了使采樣點(diǎn)能更準(zhǔn)確反映不同的土壤發(fā)育年限，更具代表性，在每個(gè)樣區(qū)內(nèi)以S形設(shè)置6個(gè)采樣點(diǎn)，各采樣點(diǎn)間距約為10～15 m，用土鉆取表層0～20 cm鮮土，并將該6個(gè)采樣點(diǎn)的土壤均勻混合成1個(gè)混合樣本，作為一個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次。放入冰盒中迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤理化性質(zhì)的分析測(cè)定主要參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[20]。土壤總有機(jī)碳采用濃硫酸-重鉻酸鉀消煮-硫酸亞鐵滴定法測(cè)定。土壤全氮含量采用半微量凱氏定氮法測(cè)定。土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮用2 mol·L-1KCl溶液浸提后，采用AA3流動(dòng)分析儀測(cè)定。土壤pH采用水土比為2.5∶1提取后，用數(shù)字酸度計(jì)測(cè)定；土壤硫酸根含量采用離子色譜法測(cè)定。

1.3 CH4產(chǎn)生潛力測(cè)定

將5 g新鮮土壤樣品放入40 mL的厭氧培養(yǎng)瓶中，加入10 mL過(guò)0.45μm濾膜的超純水，用膠塞密封后抽真空-充氬氣重復(fù)3次，以去除瓶中的氧氣，達(dá)到嚴(yán)格厭氧狀態(tài)。室溫25℃避光條件下預(yù)培養(yǎng)7 d，以盡可能去除瓶中殘余O2分子。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，再抽真空-充氬氣3次，進(jìn)行正式培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)期間每2 d從培養(yǎng)瓶頂部抽取500μL氣體測(cè)定CH4濃度。每次采氣前用力搖晃培養(yǎng)瓶60 s，使瓶?jī)?nèi)氣-液相甲烷濃度平衡；采氣后補(bǔ)充等量的氬氣以保證培養(yǎng)瓶中氣壓不變，且在計(jì)算CH4濃度變化率時(shí)需將采氣引起的CH4損耗量考慮在內(nèi)。采用安捷倫氣相色譜儀（7890N型）測(cè)定CH4濃度。土壤產(chǎn)甲烷速率通過(guò)分析培養(yǎng)期間瓶?jī)?nèi)CH4濃度的變化情況進(jìn)行計(jì)算，公式如下：

式中：P是產(chǎn) CH4速率，ng CH4·g-1·d-1；d c/d t為培養(yǎng)期間培養(yǎng)瓶上部氣相CH4濃度變化率，μL·L-1·d-1；V為培養(yǎng)瓶上部氣體體積，L；W為培養(yǎng)的干土質(zhì)量，g；MW為甲烷摩爾質(zhì)量，g·mol-1；MV為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下氣體摩爾體積，22.4 L·mol-1；Tst為標(biāo)準(zhǔn)溫度，K；T為培養(yǎng)溫度，℃。

1.4 土壤DNA提取

取0.5 g土壤樣品，用Fast DNA Spin kit for soil試劑盒（MP Biomedicals，USA）提取土壤樣品中的總DNA。用分光光度計(jì)（NanoDrop-1000 UV-Vis）測(cè)定土壤DNA濃度和純度。土壤DNA保存于-80℃冰箱待用。

1.5 定量PCR擴(kuò)增

采用C1000TMReal-Time System擴(kuò)增儀定量擴(kuò)增產(chǎn)甲烷菌的mcr A基因拷貝數(shù)。PCR擴(kuò)增所用引物為ME1/ME2。反應(yīng)體系為20μL：包括DNA樣品1μL、Taq DNA聚合酶10μL、前后引物各0.5μL、無(wú)菌水8 μL。

提取產(chǎn)甲烷菌mcr A基因的重組質(zhì)粒，先測(cè)序驗(yàn)證，再用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，并用無(wú)菌水將質(zhì)粒稀釋6～8個(gè)梯度，用于制作定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該曲線計(jì)算目的基因的拷貝數(shù)。

1.6 高通量測(cè)序

使用古菌通用引物Arc519/Arc806對(duì)古菌的16S rRNA基因的V4區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：稀釋后的DNA 2μL，Premix TaqTM25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，用滅菌后的去離子水補(bǔ)至50μL。519F/806R的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95.0℃，15 min；變性95 ℃，20 s；退火55 ℃，30 s；延伸，72 ℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.2%（m/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否擴(kuò)增出特異條帶，使用的Marker為DL2000TM，電泳電壓設(shè)置為180 V。

用OMEGA D6492試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后用AxyPrep DNA試劑盒回收凝膠后測(cè)定DNA的濃度和純度。

將切膠回收的產(chǎn)物送到中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所測(cè)試分析中心進(jìn)行建庫(kù)，并在Illununa MiSeq測(cè)序儀上進(jìn)行16SrRNA基因的高通量測(cè)序，獲得下機(jī)數(shù)據(jù)后利用QIIME 1.9.1軟件進(jìn)行處理。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)單因素方差分析（One-way ANOVA）和Pearson分析土壤理化性質(zhì)、微生物豐度的差異性以及相關(guān)性檢驗(yàn)，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濕地土壤的理化性質(zhì)變化特征

崇明島濕地不同圍墾年限土壤理化性質(zhì)如表1所示。圍墾稻田的土壤總有機(jī)碳（TOC）在15.29～18.34 g·kg-1，顯著高于未圍墾的自然灘涂濕地，且隨圍墾年限增加有逐漸增加的趨勢(shì)。土壤總氮（TN）含量介于0.84～1.20 g·kg-1，圍墾稻田與自然濕地之間沒(méi)有明顯差異。圍墾稻田土壤NH+4和NO-3含量分別為14.48～23.37 mg·kg-1和 11.79～18.67 mg·kg-1，比光灘濕地（BF）土壤分別高出1.2～2.7倍和0.8～1.9倍。未圍墾灘涂濕地（BF和PA）土壤的pH值介于7.67～7.86，顯著高于圍墾稻田。圍墾稻田的土壤SO2-4濃度范圍是196～300 mg·kg-1，顯著低于光灘濕地（BF）和蘆葦濕地（PA）。圍墾稻田的土壤EC值顯著低于自然濕地，且隨圍墾年限增加而顯著降低。

2.2 不同濕地土壤的甲烷產(chǎn)生潛力差異

如圖1所示，光灘濕地的甲烷產(chǎn)生潛力最低，僅為 3.36 ng CH4·g-1·d-1，蘆葦濕地的甲烷產(chǎn)生潛力為4.95 ng CH4·g-1·d-1，比光灘濕地高出32%。圍墾稻田的甲烷產(chǎn)生潛力速率范圍為8.3～23.2 ng CH4·g-1·d-1，且隨著圍墾年限增加而顯著增加。圍墾稻田甲烷產(chǎn)生潛力速率均值是自然灘涂濕地的3.3倍。

表1 不同圍墾年限土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of soils with different reclamation years

2.3 不同濕地土壤產(chǎn)甲烷菌的絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度

光灘濕地中產(chǎn)甲烷菌的mcr A基因拷貝數(shù)為2.4×106copies·g-1，比蘆葦濕地中低一個(gè)數(shù)量級(jí)（表2）。圍墾稻田中mcr A基因拷貝數(shù)為1.101×108～1.443×108copies·g-1，隨著圍墾年限增長(zhǎng)而增加。根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果計(jì)算出產(chǎn)甲烷菌占整個(gè)古菌的百分比表征其相對(duì)豐度值?？梢钥闯?，光灘濕地的產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度顯著低于蘆葦濕地和圍墾稻田，在圍墾稻田中隨圍墾年限增長(zhǎng)而相對(duì)豐度增加；其中，圍墾51年和86年的稻田中相對(duì)豐度比灘涂自然濕地高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的豐度值隨趨內(nèi)陸方向和圍墾年限增長(zhǎng)而數(shù)量級(jí)水平增加，其中圍墾86年稻田的相對(duì)豐度比光灘濕地增加了近100倍。乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的豐度值在各采樣點(diǎn)中處于一個(gè)數(shù)量級(jí)，其中圍墾稻田中沒(méi)有顯著差異。甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的豐度值在光灘中最高，隨著趨內(nèi)陸方向和圍墾年限增長(zhǎng)而數(shù)量級(jí)水平減小，其中圍墾86年稻田中的豐度值不足光灘濕地的1%。高通量測(cè)序分析土壤古菌16SrRNA多樣性發(fā)現(xiàn)，H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌主要包括甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷礫菌屬（Methanoregula）和Methanocella屬。其中，甲烷桿菌屬（Methanobacterium）是優(yōu)勢(shì)屬，比其他兩個(gè)屬的相對(duì)豐度高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)。各樣點(diǎn)濕地土壤中均檢測(cè)到乙酸型產(chǎn)甲烷菌，為甲烷鬃菌屬（Methanosaeta），相對(duì)豐度變異較小。甲基型產(chǎn)甲烷菌只檢測(cè)到兩個(gè)屬，是甲烷葉菌屬（Methanolobus，Methanimicrococcus）和甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina），其中甲烷葉菌屬M(fèi)ethanolobus是優(yōu)勢(shì)屬。

2.4 產(chǎn)甲烷速率與土壤性質(zhì)和產(chǎn)甲烷菌豐度之間的相關(guān)性分析

圖1 不同采樣點(diǎn)土壤甲烷產(chǎn)生速率Figure 1 CH4 production rate

表2 產(chǎn)甲烷菌功能基因mcr A的拷貝數(shù)及不同營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌16SrRNA基因的相對(duì)豐度Table 2 Absolute abundance of mcr A gene copies and relative abundance of 16SrRNA gene copies

產(chǎn)甲烷速率與土壤TOC的回歸方程達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明土壤TOC是影響產(chǎn)甲烷速率非常重要的環(huán)境要素（表3）。產(chǎn)甲烷速率與土壤TN的回歸方程沒(méi)有達(dá)到顯著水平，而活性氮（NH+4+NO-3）含量與產(chǎn)甲烷速率的回歸方程達(dá)到顯著水平，說(shuō)明土壤活性氮在一定程度上影響土壤的甲烷產(chǎn)生過(guò)程。相反，產(chǎn)甲烷速率與土壤SO24-含量之間的相關(guān)性表現(xiàn)為負(fù)對(duì)數(shù)回歸方程，且達(dá)到極顯著水平。說(shuō)明隨著圍墾年限增加土壤SO24-含量降低，是產(chǎn)甲烷速率顯著增加的主控因素之一。產(chǎn)甲烷速率與土壤中mcr A基因拷貝數(shù)表現(xiàn)為極顯著的線性關(guān)系，說(shuō)明產(chǎn)甲烷菌功能基因mcr A數(shù)量的增加是產(chǎn)甲烷速率增加的重要因素。

對(duì)各營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度與土壤TOC和SO24-含量進(jìn)行了回歸分析（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的豐度值與土壤TOC之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，而與土壤SO24-含量之間存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌豐度值與TOC和SO24-含量之間的回歸方程均未達(dá)到顯著水平。甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌豐度值與土壤TOC之間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與土壤SO24-含量之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

將各營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌豐度值取自然對(duì)數(shù)后，分析其與產(chǎn)甲烷速率之間的相互關(guān)系（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)甲烷速率與H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌豐度值存在顯著的正線性關(guān)系，與乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌豐度值之間的線性方程沒(méi)有達(dá)到顯著水平；而與甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌豐度值之間存在極顯著的負(fù)相關(guān)。

表3 產(chǎn)甲烷速率與土壤理化性質(zhì)之間的回歸方程Table 3 Regression relationship between CH4 production potential（y）and soil characteristics（x）

圖2 不同營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析Figure 2 Relationship between the relative abundance of three methanogen groups and soil characteristics

3 討論

人工圍墾造田的土地利用方式促使濱海土壤的理化性質(zhì)發(fā)生了顯著改變[10-11]，這種利用方式會(huì)深刻影響該地區(qū)濕地土壤的產(chǎn)甲烷過(guò)程。本試驗(yàn)結(jié)果表明，圍墾稻田中產(chǎn)甲烷速率均值達(dá)到13.8 ng CH4·g-1·d-1，是自然灘涂濕地的3.3倍，說(shuō)明圍墾造田工程誘發(fā)了土壤甲烷的大量排放，這可能與土壤理化性質(zhì)的變化密切相關(guān)。其中，圍墾促使土壤的電導(dǎo)率和SO2-4離子濃度顯著下降以及圍墾后農(nóng)耕種稻導(dǎo)致土壤TOC含量增加，是導(dǎo)致濱海濕地甲烷產(chǎn)生速率增加的主要原因。一般認(rèn)為，濱海濕地土壤環(huán)境中存在的高濃度SO2-4離子會(huì)強(qiáng)烈抑制產(chǎn)甲烷過(guò)程[21]，其原因是土壤中的硫酸鹽還原菌在與產(chǎn)甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)電子供體時(shí)具有明顯優(yōu)勢(shì)[22]；且濱海濕地表層土壤受到潮汐沖洗外力作用的影響，土壤有機(jī)物及電子供體普遍缺乏，這更加劇了硫酸鹽還原菌對(duì)產(chǎn)甲烷菌的底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制。另一方面，圍墾稻田位于海堤之內(nèi)，不再受海水潮汐作用的影響，土壤鹽分總濃度和SO42-離子顯著下降；并且受種稻、施肥、耕作等農(nóng)業(yè)措施的強(qiáng)烈影響，土壤性質(zhì)發(fā)生顯著改變，表現(xiàn)為TOC、TN和活性氮顯著增加，對(duì)產(chǎn)甲烷過(guò)程具有重要的促進(jìn)作用。

圖3 產(chǎn)甲烷速率與各營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度自然對(duì)數(shù)值的相關(guān)性Figure 3 Relationships between the CH4 production rate andln（relative abundance of acetotrophic，hydrogenotrophic and facultative methanogens）

本試驗(yàn)定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)甲烷菌功能基因mcr A拷貝數(shù)為2.4×106～1.443×108copies·g-1，隨著趨陸方向和圍墾年限增長(zhǎng)而顯著增加，說(shuō)明功能基因mcr A數(shù)量增加是產(chǎn)甲烷速率增大的微生物學(xué)機(jī)理之一。Yuan等[23]報(bào)道，在蘇北濱海濕地中產(chǎn)甲烷速率與產(chǎn)甲烷菌的16SrRNA基因拷貝數(shù)呈顯著正相關(guān)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)甲烷菌16SrRNA基因的相對(duì)豐度隨著趨陸方向和圍墾年限增長(zhǎng)而數(shù)量級(jí)水平增加，其與功能基因mcr A的變化趨勢(shì)完全相同，且與產(chǎn)甲烷速率顯著正相關(guān)。可見(jiàn)，灘涂濕地圍墾改造為稻田后，提高了產(chǎn)甲烷菌的絕對(duì)數(shù)量和相對(duì)豐度，這可能與土壤TOC增加、SO2-4離子下降密切相關(guān)。

根據(jù)電子底物利用和代謝途徑的差異，產(chǎn)甲烷過(guò)程分為H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型、乙酸營(yíng)養(yǎng)型和甲基營(yíng)養(yǎng)型途徑，它們對(duì)產(chǎn)甲烷速率的貢獻(xiàn)隨著環(huán)境因素的變化而各異[15-18]。已有研究發(fā)現(xiàn)，H2/CO2和乙酸營(yíng)養(yǎng)型途徑是淡水濕地產(chǎn)甲烷過(guò)程的兩種主要途徑，理論上對(duì)總甲烷產(chǎn)生量的貢獻(xiàn)達(dá)到90%以上[24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的相對(duì)豐度在不同采樣點(diǎn)中處于同一數(shù)量級(jí)，差異不大；而H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度隨著趨陸方向而數(shù)量級(jí)水平增加，是產(chǎn)甲烷菌總相對(duì)豐度值發(fā)生分異的主要貢獻(xiàn)者。在濱海濕地中H2/CO2和乙酸等底物更多地被硫酸鹽還原菌利用，而不是產(chǎn)甲烷菌。所以這兩類營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌被強(qiáng)烈抑制，不是光灘濕地和蘆葦濕地的主要產(chǎn)甲烷過(guò)程。而在圍墾稻田中，耕作層在人工施肥、水稻根系生長(zhǎng)等因素影響下，土壤TOC及活性有機(jī)碳含量明顯增加，為H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型和乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌提供了豐富的電子底物，促進(jìn)了產(chǎn)甲烷過(guò)程。在本試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)，主要表現(xiàn)為對(duì)H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的刺激作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌主要包括3個(gè)屬，其中以甲烷細(xì)菌屬（Methanobacterium）為主，是H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度發(fā)生分異的主要貢獻(xiàn)者。各采樣點(diǎn)中甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的相對(duì)豐度以光灘濕地為最高，且占產(chǎn)甲烷菌總相對(duì)豐度的81%。說(shuō)明近岸濱海濕地中甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌是產(chǎn)甲烷過(guò)程的主要貢獻(xiàn)者。已有研究發(fā)現(xiàn)，甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌可以利用甲胺類、甲硫醇類和甲醇等C1甲基化合物產(chǎn)生甲烷，而硫酸鹽還原菌不能利用這類甲基化合物，對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌不會(huì)產(chǎn)生底物性抑制作用[14]。因而在SO2-4含量豐富的濱海濕地中，C1甲基化合物歧化作用是產(chǎn)甲烷過(guò)程的主要途徑[25]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)中甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌主要包括2個(gè)屬，其中以甲烷葉菌屬（Methanolobus）為主，是甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度發(fā)生分異的主要貢獻(xiàn)者。

綜上所述，圍墾種稻的土地利用方式改變了土壤的理化性質(zhì)，促進(jìn)了產(chǎn)甲烷過(guò)程。圍墾稻田中產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量大幅度增加，是產(chǎn)甲烷速率增加的主要原因。其中H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌是產(chǎn)甲烷菌總量發(fā)生變異的主要貢獻(xiàn)者。

4 結(jié)論

（1）濱海灘涂濕地圍墾改造為稻田的土地利用方式，顯著降低了土壤鹽分總濃度和SO2-4離子濃度，促進(jìn)了耕層土壤的產(chǎn)甲烷速率。

（2）灘涂濕地圍墾為稻田后，產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量大幅度增加，且隨著種稻年限的增長(zhǎng)而顯著增加；其中，H2/CO2營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度大幅增加是產(chǎn)甲烷菌總量發(fā)生變異的主要原因。

致謝：在本試驗(yàn)的野外采樣過(guò)程中，上海崇明東灘濕地自然保護(hù)區(qū)給予了大力支持和協(xié)助，在此表示衷心感謝！