天津市家庭農(nóng)場(chǎng)養(yǎng)殖糞污耐藥基因賦存特征及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

谷艷茹，韓秉君，黃繼元，楊鳳霞*，張克強(qiáng)*

在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中，抗生素因具有預(yù)防疾病、提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)等功效，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)被廣泛應(yīng)用[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年我國(guó)抗生素使用總量約16.2萬(wàn)t，其中獸用抗生素占一半以上，高達(dá)52%[2]。獸用抗生素濫用會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物腸道內(nèi)產(chǎn)生大量含有抗生素耐藥基因（ARGs）的耐藥性細(xì)菌，進(jìn)而增加疾病的治療難度[3]?，F(xiàn)如今我國(guó)推行畜禽糞污的還田利用，而大量的耐藥性細(xì)菌和耐藥基因隨著糞污排出動(dòng)物體外[4]，并以糞肥、肥水的形式進(jìn)入農(nóng)田土壤，最終危害人類健康[5]。

抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的長(zhǎng)期、大量使用，導(dǎo)致我國(guó)畜禽環(huán)境中ARGs污染形勢(shì)十分嚴(yán)峻。Ji等[6]在規(guī)?；i場(chǎng)和牛場(chǎng)糞污中檢測(cè)到磺胺類耐藥基因（sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ和sul A）和四環(huán)素類耐藥基因（tet O、tet W、tet M和tet B），其中sul A、sul1和tet W在兩種糞污中均顯示較高豐度；Mu等[7]在規(guī)?；u場(chǎng)糞污中發(fā)現(xiàn)喹諾酮類耐藥基因oqx B和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm B，其絕對(duì)濃度分別達(dá) 3.5×1010、2×109copies·g-1；此外，在大規(guī)模養(yǎng)殖的豬場(chǎng)和雞場(chǎng)糞污中也有研究[8]調(diào)查了氨基糖苷類、氯霉素類和萬(wàn)古霉素類等耐藥基因，結(jié)果顯示各類耐藥基因在所測(cè)樣本中均有檢出。值得關(guān)注的是，在規(guī)?；B(yǎng)殖的畜禽環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了與人類健康密切相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)耐藥基因。如有學(xué)者在部分雞場(chǎng)糞污中檢出了絕對(duì)豐度高達(dá)106～107copies·g-1的blaTEM[9]；同時(shí)Yang等[10-11]在規(guī)模化豬場(chǎng)糞污中還發(fā)現(xiàn)了blaOXA-1、blaTEM-1、blaGES-1等十余種β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，并證實(shí)豬場(chǎng)糞污是高風(fēng)險(xiǎn)耐藥基因blaNDM和mcr-1的重要儲(chǔ)庫(kù)。另外，近年來(lái)畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中具有多重耐藥性的“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)[12]，進(jìn)一步凸顯了養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌耐藥問題的嚴(yán)重性。

目前，畜禽糞污中ARGs的污染問題已引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注，相關(guān)報(bào)道亦陸續(xù)增多。然而現(xiàn)有報(bào)道主要集中在規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染研究，而有關(guān)家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染規(guī)律及其對(duì)農(nóng)田環(huán)境的影響尚不清楚，仍缺乏相關(guān)的研究數(shù)據(jù)?，F(xiàn)如今，家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽養(yǎng)殖是我國(guó)鄉(xiāng)村地區(qū)的主要養(yǎng)殖方式，具有養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)量多、養(yǎng)殖地點(diǎn)分散、抗生素使用不規(guī)范、糞污收集困難且缺乏后續(xù)處理設(shè)施等特點(diǎn)[13]。其產(chǎn)生的糞污未經(jīng)處理或者處理不當(dāng)而隨意排放給農(nóng)村生態(tài)環(huán)境造成了巨大壓力，由此引起的環(huán)境污染日益嚴(yán)重，對(duì)公共健康的危害不容忽視。因此，解析家庭農(nóng)場(chǎng)養(yǎng)殖糞污中ARGs污染情況及其潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于全面了解和控制我國(guó)畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染亦十分必要。

天津市薊州區(qū)家庭農(nóng)場(chǎng)具有分布廣、數(shù)量多（600～700家）、養(yǎng)殖畜種豐富等特點(diǎn)，是研究家庭農(nóng)場(chǎng)的典型區(qū)域。因此，本研究選取天津市薊州區(qū)22家糞污還田達(dá)2年以上的具有代表性的家庭農(nóng)場(chǎng)（8家豬場(chǎng)、8家牛場(chǎng)和6家雞場(chǎng)）作為考察對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)養(yǎng)殖糞污及施用糞肥的農(nóng)田土壤中ARGs進(jìn)行了全面調(diào)查。比較天津市薊州區(qū)家庭農(nóng)場(chǎng)不同畜種間常見ARGs的污染特征及差異性；詳細(xì)分析不同畜種及其周邊環(huán)境中常見ARGs的多樣性及污染水平；特別針對(duì)與人類健康密切相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)β-內(nèi)酰胺類ARGs和多黏菌素耐藥基因mcr-1，評(píng)估其在家庭農(nóng)場(chǎng)中的分布及污染狀況；探討家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽糞肥的施用對(duì)農(nóng)田土壤中ARGs的影響及存在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。本研究提供了家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中各類抗生素耐藥基因的綜合概況，為家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中獸用抗生素的管理和使用提供參考，以期減輕這些高風(fēng)險(xiǎn)耐藥決定因子的傳播。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品于2018年冬季在天津市薊州區(qū)（北緯39°45'～40°15'，東經(jīng)117°05'～117°47'）22家典型的家庭農(nóng)場(chǎng)內(nèi)采集，包括8家豬場(chǎng)、8家牛場(chǎng)和6家雞場(chǎng)，共38個(gè)糞便樣品和44個(gè)土壤樣品。糞便樣品主要采自舍內(nèi)新鮮糞便，試驗(yàn)土壤為施用糞肥2年以上的農(nóng)田土壤，對(duì)照土壤則是在同區(qū)域未施用糞肥或少有人活動(dòng)的地方采集。養(yǎng)殖場(chǎng)分布的詳細(xì)信息見圖1。

1.2 樣品采集及預(yù)處理

根據(jù)糞堆的大小分別收集3～5個(gè)糞便樣本，采樣方法按照《畜禽糞便監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》（GB/T 25169—2010）操作。土壤樣品采用梅花采樣法采集0～15 cm耕層土壤，采樣方法按照《農(nóng)田土壤環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》（NY/T 39—2012）操作。將糞便和土壤樣品使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行處理后，將等量的離散子樣品混合，并通過(guò)2 mm的網(wǎng)篩制備復(fù)合樣品。樣品預(yù)處理完成后于-20℃保存至實(shí)驗(yàn)室，等待DNA提取。

1.3 DNA提取及PCR反應(yīng)

圖1 天津市薊州區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)分布圖Figure 1 Distribution map of livestock farms in Jizhou area of Tianjin

采用Fast DNA SPIN Kit for soil試劑盒（MPBiomedicals，LLC，Santa Ana，CA，美國(guó)）按操作手冊(cè)對(duì)0.5 g糞便和0.5 g土壤進(jìn)行DNA提取，采用超微量紫外可見光分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品純度。對(duì)每個(gè)DNA模板進(jìn)行普通PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix（TransGen Biotech，Beijing，China）、上下游引物各 0.5 μL（10 μmol·L-1）、0.5 μL DNA模板和11μL ddH2O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)包括95℃變性30 s，退火30 s（退火溫度詳見表1），72 ℃延伸30 s至1 min。特異性引物詳細(xì)信息見表1。最后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否含有目的基因，詳細(xì)步驟見參考文獻(xiàn)[14]。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

本研究對(duì)21個(gè)ARGs進(jìn)行qPCR檢測(cè)，使用儀器7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems美國(guó)）進(jìn)行實(shí)時(shí)qPCR分析。將提取的DNA樣品稀釋10倍，qPCR反應(yīng)體系為20μL，包括10.0μL TB Green Premix Ex Taq（Tli RNase H Plus，Takara）、上下游引物各 0.4μL、0.4μL ROX Reference DyeⅡ、6.8μL ddH2O和2μL DNA模板。兩步法qPCR擴(kuò)增過(guò)程如下：預(yù)變性95℃持續(xù)30 s，隨后是40個(gè)循環(huán)包括95℃變性5 s，60℃退火/延伸持續(xù)34 s，熔點(diǎn)曲線分析在60～95℃之間進(jìn)行。每個(gè)DNA模板設(shè)置3個(gè)平行，無(wú)菌水為陰性對(duì)照，qPCR反應(yīng)程序和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照文獻(xiàn)[10]。最終換算為樣品中耐藥基因的相對(duì)濃度（ARGs copies/16SrRNA gene copies）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析，以P＜0.05作為差異顯著水平。采用R軟件的pheatmap制作熱圖，RStudio軟件的Boxplot制作箱線圖，利用Origin 2017繪制了土壤分析柱狀圖。數(shù)據(jù)的相對(duì)豐度、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算均使用Excel 2007。

2 結(jié)果與討論

2.1 家庭農(nóng)場(chǎng)養(yǎng)殖糞污中常見耐藥基因的總體污染特征及差異性

為了研究家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽糞污中ARGs的污染特征及分布規(guī)律，本文在薊州區(qū)選取22家典型的養(yǎng)殖場(chǎng)（包括牛場(chǎng)、雞場(chǎng)和豬場(chǎng)），針對(duì)常見的5類典型抗生素的15種ARGs進(jìn)行了系統(tǒng)的調(diào)查。從耐藥基因的賦存來(lái)看（圖2），磺胺類耐藥基因（sul1和sul2）、四環(huán)素類耐藥基因（tet O、tet Q、tet W、tet X和tet L）、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因（erm B和erm C）和鏈霉素類耐藥基因（aad A、str A和str B）遍及所有樣品，檢出率為100%（38/38）；而喹諾酮類耐藥基因qnr S、qnr B和oqx B的檢出率為73%（28/38）、94%（36/38）和92%（35/38），由此可見，磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和鏈霉素類耐藥基因在家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽糞污中存在范圍最廣。這主要是因?yàn)檫@幾類抗生素具有抗菌廣、見效快和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)，導(dǎo)致其相應(yīng)的ARGs在畜禽糞污中蓄積[20]。

表1 PCR引物的詳細(xì)信息Table 1 The detail information of PCRprimer

圖2 家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽養(yǎng)殖糞污及其周邊土壤中ARGs的相對(duì)豐度Figure 2 The relative abundance of ARGs in livestock waste and surrounding soils from family farms

值得注意的是，喹諾酮類耐藥基因（oqx B、qnr S和qnr B）在豬場(chǎng)糞污中不僅檢出率為100%，其污染水平（10-6～10-3）也顯著高于雞場(chǎng)（10-7～10-4）和牛場(chǎng)（10-8～10-6）（P＜0.05），其原因可能是動(dòng)物飼料中該類抗生素的添加方式不同，以及不同畜種間腸道菌群存在差異[21]。然而，喹諾酮類以外的其他類耐藥基因在雞場(chǎng)糞污中的相對(duì)豐度（10-4～10-2）卻比豬場(chǎng)（10-5～10-2）和牛場(chǎng)（10-6～10-3）更為嚴(yán)重，這與規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)不同畜禽糞污中ARGs的賦存特征一致[8]。雞的養(yǎng)殖密度大且銷售周期短，使用的抗生素劑量遠(yuǎn)高于豬場(chǎng)和牛場(chǎng)；另外，與哺乳動(dòng)物豬和牛相比，雞的消化功能較差，容易造成腸道內(nèi)抗生素的殘留，為耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生提供了有利條件[22]，由此導(dǎo)致雞場(chǎng)中ARGs污染嚴(yán)重。此外，調(diào)查還發(fā)現(xiàn)在同一養(yǎng)殖場(chǎng)不同豬群的發(fā)育階段中ARGs的多樣性與豐度也有所不同，例如母豬糞中 ARGs的污染水平（10-3～100）顯著高于育肥豬（10-3～10-5）和仔豬（10-4～10-2）（P＜0.05），這可能與其飼料配比、使用劑量和頻率的差異有關(guān)[6]。

2.2 不同家庭農(nóng)場(chǎng)養(yǎng)殖糞污中常見抗生素耐藥基因的污染分析

不同畜禽糞污中耐藥基因的相對(duì)含量如圖3所示。在雞場(chǎng)糞污中（圖3A），除了喹諾酮類ARGs，其他類耐藥基因均以高濃度普遍存在。其中，sul1、sul2、tet O、tet Q、tet W、tet L、tet X、str A、str B、aad A、erm B和erm C賦存水平相對(duì)較高，數(shù)量級(jí)高達(dá)10-3～100；而喹諾酮類耐藥基因qnr B、qnr S和oqx B的相對(duì)豐度僅為10-7～10-4。特別值得注意是，磺胺類耐藥基因sul1和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm B在雞場(chǎng)糞污中的豐度顯著高出其他類耐藥基因（P＜0.05），達(dá)到10-2～100，其污染最為嚴(yán)重的原因可能是sul1位于可移動(dòng)遺傳元件int1和int2上，可以促進(jìn)sul1在微生物群落中的持久性[23]；以及類似Tn1545-like轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)基因元件可促進(jìn)erm B在不同介質(zhì)間轉(zhuǎn)移，提高了其在糞污環(huán)境中的污染水平[24]。此外，關(guān)于四環(huán)素類ARGs的研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制的基因含量高于其他表達(dá)機(jī)制[25]，而在本研究中表達(dá)核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制的基因tet O、tet Q、tet W與編碼外排泵基因tet L和酶修飾基因tet X的相對(duì)豐度卻在同一污染水平（10-3～10-1）；tet L和tet X濃度偏高的原因可能是薊州區(qū)雞場(chǎng)糞污環(huán)境與其傳播機(jī)制相互作用的結(jié)果。另外，從污染水平來(lái)看，還發(fā)現(xiàn)家庭農(nóng)場(chǎng)的雞場(chǎng)糞污中耐藥基因的豐富度高于規(guī)?；u場(chǎng)糞污，如Mu等[7]在天津市規(guī)模化雞場(chǎng)中的調(diào)查結(jié)果顯示四環(huán)素類耐藥基因tet W和tet X豐度水平為10-2～10-1，而本研究中相應(yīng)的四環(huán)素類耐藥基因的最高含量卻達(dá)到了100；同時(shí)sul1和erm B的污染水平也比規(guī)?；u場(chǎng)中相應(yīng)耐藥基因的水平高出1～2個(gè)數(shù)量級(jí)[26]。

與雞場(chǎng)糞污中ARGs不同的是，豬場(chǎng)糞污中所有耐藥基因包括喹諾酮類ARGs普遍存在（圖3B），且tet O、tet Q、tet W、tet X、tet L和erm B的污染相對(duì)較嚴(yán)重，其水平高達(dá)10-3～100。從圖2B還可以明顯看出，四環(huán)素類耐藥基因tet O和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm B在豬場(chǎng)糞污中的相對(duì)水平顯著高出其他類耐藥基因，均達(dá)到10-2～100。其中tet O普遍存在偶聯(lián)質(zhì)粒上，增加了其水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[27]；erm B的宿主菌如腸球菌等在糞污中廣泛分布[24]，由此導(dǎo)致tet O和erm B含量偏高。從四環(huán)素的抗性機(jī)制角度分析，發(fā)現(xiàn)豬糞中編碼核糖體保護(hù)蛋白基因tet O、tet Q和tet W的相對(duì)含量（10-2～100）顯著高于編碼外排泵基因tet L（10-3～10-2）和酶修飾基因 tet X（10-3～10-1）（P＜0.05），這可能由于核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制是動(dòng)物胃腸道中四環(huán)素抗性的主導(dǎo)機(jī)制，且與接合質(zhì)粒和整合子等密切相關(guān)造成的[27]，同時(shí)該規(guī)律與Chen等[23]研究結(jié)論一致。此外，雖然喹諾酮類ARGs在豬場(chǎng)糞污中均有檢出，但其污染水平不高，僅為10-7～10-4；qnr S和qnr B同為質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因[28]，而前者的污染水平（10-5～10-3）顯著高于后者（10-7～10-5）（P＜0.05），其原因可能是本試驗(yàn)所測(cè)的區(qū)域環(huán)境不利于相應(yīng)菌落的生長(zhǎng)繁殖。有學(xué)者對(duì)規(guī)?；i場(chǎng)ARGs的分析中發(fā)現(xiàn)，erm B、str A、sul1、tet O、tet Q、tet W和tet X的污染較嚴(yán)重，相對(duì)含量在10-6～10-1范圍內(nèi)[8，29]，而上述基因在家庭豬場(chǎng)中的污染水平均較高，最高達(dá)100。薊州區(qū)家庭農(nóng)戶主要依靠經(jīng)驗(yàn)養(yǎng)殖，養(yǎng)殖技術(shù)不完善、不規(guī)范和不標(biāo)準(zhǔn)，這是其污染較重的主要原因[30]。

相比于雞場(chǎng)和豬場(chǎng)，牛場(chǎng)糞污中各類耐藥基因的污染水平稍低，其相對(duì)豐度范圍為10-6～10-1（圖3C）。四環(huán)素類耐藥基因tet O、tet Q、tet W和tet X在牛場(chǎng)糞污中的相對(duì)豐度最高，可達(dá)10-2～10-1；磺胺類基因（sul1和sul2）、大環(huán)內(nèi)酯類基因（erm B和erm C）和鏈霉素類基因（aad A、str A和str B）的污染水平次之，相對(duì)濃度為 10-4～10-2。tet L（10-6～10-4）的相對(duì)含量顯著低于其他四環(huán)素類耐藥基因，原因可能是tet L在牛場(chǎng)糞污中的相關(guān)菌屬內(nèi)分布有限。此外，喹諾酮類耐藥基因在牛場(chǎng)糞污中的污染水平相比于其他類的耐藥基因亦是最低，僅為10-8～10-6，這與雞場(chǎng)和豬場(chǎng)結(jié)果相似。原因可能是牛本身對(duì)喹諾酮類抗生素?cái)z入較少導(dǎo)致糞污中的含量最低。

2.3 高風(fēng)險(xiǎn)耐藥基因在家庭農(nóng)場(chǎng)養(yǎng)殖糞污中的污染情況及賦存規(guī)律

本研究針對(duì)家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽糞污中高風(fēng)險(xiǎn)的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（bla基因）和多黏菌素耐藥基因mcr-1進(jìn)行了詳細(xì)調(diào)查。高風(fēng)險(xiǎn)耐藥基因在家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽糞污中的分布情況見圖2。從圖中可知，blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1在家庭農(nóng)場(chǎng)（豬、雞和牛）中存在普遍，檢出率均為100%（38/38）；此外，mcr-1和blaNDM也有較高的檢出率，分別達(dá)84%（32/38）和76%（29/38）；而blaGES-1的檢出數(shù)量?jī)H占總樣品的39%（15/38）。以上結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)bla基因中blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1在家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽糞污中較為常見，意味著這些基因及其宿主細(xì)菌在目標(biāo)養(yǎng)殖場(chǎng)存在高普遍性。

圖4表示養(yǎng)殖糞污中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥基因的相對(duì)含量。如圖所示，除blaGES-1外，3種糞污中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥基因 的 相 對(duì) 豐 度 大 小 一 致 為 blaampC＞blaTEM-1＞blaOXA-1＞blaNDM＞mcr-1，與本課題組Yang等[10-11]在規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)報(bào)道的結(jié)果類似。其中blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1在豬場(chǎng)、雞場(chǎng)和牛場(chǎng)糞污中均為主導(dǎo)基因，且相對(duì)豐度較高，分別達(dá) 10-5～10-2、10-4～10-1和 10-6～10-3，與各養(yǎng)殖場(chǎng)中常見的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm C的污染水平相似。牛場(chǎng)中blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1的污染水平較低，其與不同畜禽的代謝能力及養(yǎng)殖方式的不同有著密切關(guān)系。圖2可看出，仔豬和母豬糞污中blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1的相對(duì)含量顯著高出育肥豬約1～2個(gè)數(shù)量級(jí)（P＜0.05），喂食的抗生素劑量和頻率的差異導(dǎo)致了該結(jié)果的發(fā)生。然而，與優(yōu)勢(shì)基因相比較，blaNDM和mcr-1在豬場(chǎng)、雞場(chǎng)和牛場(chǎng)糞污中的污染水平顯著偏低（P＜0.05），分別為 10-8～10-5、10-9～10-6和10-9～10-5。blaGES-1在牛場(chǎng)中未檢出，而在豬場(chǎng)和雞場(chǎng)的小部分樣品中檢出，這可能是由于相關(guān)的抗生素使用較少或牛場(chǎng)糞污環(huán)境不利于相應(yīng)菌群生長(zhǎng)導(dǎo)致。同時(shí)，Yang等[10-11]在天津市規(guī)?；i場(chǎng)的研究中顯示，bla基因和mcr-1的相對(duì)含量范圍為10-9～10-3，而本研究中相應(yīng)的高風(fēng)險(xiǎn)基因的最高含量卻達(dá)到了10-1。暗示著家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽環(huán)境中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥基因污染問題的嚴(yán)重性，同時(shí)也反映出加強(qiáng)畜禽糞污合理化處置的必要性。

圖3 家庭農(nóng)場(chǎng)中不同畜禽糞污中常見ARGs的相對(duì)豐度Figure 3 Relative abundance of common ARGs in different livestock wastesfromfamily farms

圖4 不同畜禽糞污中高風(fēng)險(xiǎn)ARGs的相對(duì)豐度Figure 4 The relative abundance of high risk ARGs in different livestock manures

2.4 家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽糞肥的施用對(duì)農(nóng)田土壤中耐藥基因污染的影響

現(xiàn)如今我國(guó)推行畜禽糞污的還田利用，以改良土壤和提高土壤肥力。為了確定家庭農(nóng)場(chǎng)的畜禽糞肥對(duì)農(nóng)田土壤中耐藥基因的影響，本研究還對(duì)長(zhǎng)期施用糞肥的農(nóng)田土壤展開了系統(tǒng)的調(diào)查。結(jié)果如圖2所示，在施用有機(jī)肥的土壤中抗生素耐藥基因普遍存在，其中磺胺類（sul1和sul2）、四環(huán)素類（tet O、tet Q、tet W、tet L和tet X）、大環(huán)內(nèi)酯類（erm B和erm C）、鏈霉素類（str A、str B和aad A）和高風(fēng)險(xiǎn)的β-內(nèi)酰胺類（blaampC、blaTEM-1和blaOXA-1）耐藥基因在所用樣品中均有檢出，其中相對(duì)含量最高的3種耐藥基因?yàn)閟ul1、sul2和tet O，均在10-4～10-2范圍內(nèi)；另外，雖然高風(fēng)險(xiǎn)基因中blaNDM和mcr-1相對(duì)水平較低，為10-7～10-5，但其在土壤中亦分布廣泛，檢出率分別達(dá)78%和75%。土壤中ARGs的高檢出表明它們?cè)谕寥拉h(huán)境中存在高穩(wěn)定性，應(yīng)引起廣泛注意。喹諾酮類耐藥基因qnr S、qnr B和oqx B檢出率最低，僅分別為27%、34%和52%。該類耐藥基因在畜禽糞污中含量低是導(dǎo)致這一結(jié)果的原因之一，其二也可能是因?yàn)榧S污的堆肥過(guò)程削減了部分喹諾酮類耐藥基因，但該想法需要進(jìn)一步驗(yàn)證。這說(shuō)明糞肥施用對(duì)農(nóng)田土壤中喹諾酮類耐藥基因的賦存影響不大。

不同畜禽糞污的處理對(duì)農(nóng)田土壤中ARGs的影響不同。通過(guò)對(duì)比未施用糞肥的對(duì)照土壤，分析糞肥施用的農(nóng)田土壤中耐藥基因的富集情況，結(jié)果如圖5所示。施用雞糞肥后的土壤中ARGs的相對(duì)豐度增加了18倍，而施用豬糞肥和牛糞肥則分別增加了14倍和8倍。由上述可得，3種糞肥的施入對(duì)土壤中ARGs影響依次為雞糞肥＞豬糞肥＞牛糞肥。該結(jié)果與不同動(dòng)物糞污中ARGs的污染規(guī)律相一致，表明家庭農(nóng)場(chǎng)糞污中ARGs的差異是造成不同糞肥土壤中ARGs污染差異的主要原因；同時(shí)不同糞肥土壤中寄主細(xì)菌的多樣性和生存能力的差異，也可導(dǎo)致ARGs的持久性不同[8，31]。顯然，畜禽糞肥的施加可顯著增加土壤環(huán)境中抗生素耐藥基因的豐度，這與以往的研究結(jié)果相一致[32-33]。此外，不同施肥土壤中相同基因的含量也有所不同（圖2），如雞糞肥土壤中sul1、emr B和blaOXA-1的相對(duì)豐度（10-2～100）顯著高于施用豬糞肥（10-3～10-2）和牛糞肥土壤（10-4～10-3）（P＜0.05），這表明同種耐藥基因在不同土壤中的持久性也有所不同。綜上分析，除了喹諾酮類ARGs在3種不同土壤中很少檢出，且mcr-1和blaNDM濃度較低外，其他基因在施肥后的土壤中均以高濃度普遍存在，由此可充分證明家庭農(nóng)場(chǎng)的畜禽糞污是農(nóng)田土壤環(huán)境中抗生素耐藥基因的一個(gè)重要污染源。因此，采用有效的糞污處理技術(shù)來(lái)控制家庭農(nóng)場(chǎng)糞肥中耐藥基因的污染問題勢(shì)在必行。

3 結(jié)論

圖5 施用不同糞肥的土壤中ARGs的相對(duì)豐度Figure 5 Relative abundance of ARGs in soil applied different animal manures

（1）家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽養(yǎng)殖糞污中常見耐藥基因污染較為普遍且存在多種耐藥機(jī)制并存的污染特點(diǎn)；高風(fēng)險(xiǎn)耐藥基因在畜禽糞污中的廣泛分布，進(jìn)一步凸顯了家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中耐藥基因污染問題的嚴(yán)重性。

（2）不同種類畜禽糞污中抗生素耐藥基因的污染程度存在差異，且不同生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)豬糞中的耐藥基因污染存在影響。

（3）家庭農(nóng)場(chǎng)畜禽糞肥的施用不僅顯著增加土壤環(huán)境中耐藥基因的豐度，也增大了耐藥基因在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)揭示出家庭農(nóng)場(chǎng)的畜禽糞污是農(nóng)業(yè)環(huán)境中耐藥基因的一個(gè)重要污染源。

（4）應(yīng)加強(qiáng)對(duì)家庭畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的管理，并針對(duì)養(yǎng)殖密集區(qū)域集中設(shè)置糞污存儲(chǔ)和處置設(shè)施，如糞污處理廠和有機(jī)肥加工廠，遵循源頭減量、過(guò)程控制和末端利用的原則，實(shí)現(xiàn)糞水肥處理技術(shù)的一體化，進(jìn)而降低環(huán)境中耐藥基因的傳播風(fēng)險(xiǎn)。