基于NOD2信號通路探討NADPH抑制劑對腎臟缺血再灌注損傷的影響

張曉林 劉文麗 李光遠 馬芳 夏田雨 李迪 張哲 覃志成

030001 太原，山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院腎內(nèi)科(張曉林，夏田雨，李迪，張哲)；831399 新疆，新疆五家渠人民醫(yī)院腎內(nèi)科(劉文麗，李光遠，馬芳)；030012 太原，山西省人民醫(yī)院腎內(nèi)科(覃志成)

急性腎損傷(AKI)是以腎功能短期內(nèi)急劇下降為特征的臨床綜合征，具有較高的發(fā)病率及死亡率[1]。腎臟缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)是急性腎衰竭發(fā)生的重要病理生理基礎(chǔ)[2]。而氧化應激作為腎臟IRI的關(guān)鍵致病機制之一，可導致腎臟實質(zhì)細胞和間質(zhì)細胞的空泡樣變性、壞死及凋亡[3]。核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-2，NOD2)受體是一類新型的胞漿內(nèi)固有免疫模式識別受體，表達于人和鼠腎小管上皮細胞，在IRI發(fā)生時NOD2受體的激活可引起炎癥因子及趨化因子的產(chǎn)生，導致AKI[4]。

本實驗采用兩種公認的NADPH氧化酶抑制劑4-羥基-3甲氧基苯乙酮(4-hydroxy-3-methoxyacetophenone，Apocynin)和氯化二碘聯(lián)苯(diphenylene iodonium，DPI)對IRI模型大鼠進行預處理，觀察是否可通過抑制氧化應激來介導腎小管上皮細胞NOD2信號通路的抑制，從而減輕IRI過程。現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、實驗材料

選取健康雄性Wistar大鼠24只，由山西醫(yī)科大學動物中心提供，質(zhì)量為180～210 g之間，常規(guī)飼養(yǎng)，禁食12 h后用于實驗。主要實驗試劑：Apocynin及DPI(Sigma公司)；兔抗大鼠NOD2(Boster公司)，抗核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)(Bioss公司)，抗半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)(Boster公司)，抗IL-1β(Bioss公司)，抗GAPDH抗體(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

二、實驗方法

1.分組 取24只雄性Wistar大鼠，通過腹腔注射10%水合氯醛(劑量為0.3 mL/100 g)進行麻醉，分離腎蒂周圍組織，暴露左腎動脈，結(jié)扎右腎蒂，切除右腎，并隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、腎臟缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)組、I/R+Apocynin組、I/R+DPI組，每組6只。其中，I/R+Apocynin組大鼠采用Apocynin以10mol/min的速度，連續(xù)10 min從左腎動脈注射，停藥3 min后用無損傷微動脈夾夾閉大鼠左側(cè)腎蒂，45 min后解除阻斷，建立大鼠IRI模型；DPI組大鼠采用DPI以1mol/min的速度，連續(xù)10 min從左腎動脈注射，停藥3 min后用無損傷微動脈夾夾閉大鼠左側(cè)腎蒂，45 min后解除阻斷；I/R組大鼠給予等體積生理鹽水，停藥3 min后用無損傷微動脈夾夾閉大鼠左側(cè)腎蒂，45 min后解除阻斷；Sham組給予等體積生理鹽水，不予夾閉左腎動脈。各組大鼠于試驗結(jié)束24 h后收集血及腎組織標本。

2.Western blot檢測 采用Western blot檢測NOD2、NF-κB蛋白、caspase-1表達，取液氮中保存的腎組織每組各取約90 mg加入適量蛋白裂解液勻漿，離心取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。每組取30 μg蛋白于SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)入NC膜；5%的脫脂奶粉封閉2 h后加入抗NOD-2及抗NF-κB(1∶2 000)、抗caspase-1(1∶2 000)，4 ℃過夜；TBST洗膜，加入HRP標記的二抗(1∶20 000)，室溫下孵育l h；ECL化學發(fā)光法曝光。以GADPH為內(nèi)參照，通過計算目標蛋白與GADPH的灰度比值進行半定量分析。

3.實時定量PCR法檢測 采用實時定量PCR法檢測NOD2 mRNA的表達。用Trizol試劑提取組織中總RNA。使用上海寶生物Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時定量PCR采用SYBR Green Master Mix試劑盒進行，每管總反應體積25L，PCR溫度循環(huán)設(shè)計：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min循環(huán)40次。待測樣品mRNA相對表達量=2-ΔΔCt×100%，以GAPDH標化各mRNA拷貝數(shù)。

4.組織病理學檢查 將大鼠腎組織切片3 μm厚，HE染色處理后，通過計數(shù)腎小管損傷面積的百分比，半定量評估腎小管間質(zhì)損傷程度，評分標準根據(jù)腎小管上皮細胞變性、壞死、刷狀緣脫落、管型形成及炎細胞浸潤程度分為：0分(無損傷)、1分(≤10%)、2分(11%～25%)、3分(26%～45%)、4分(46%～75%)、5分(>76%)。每張切片至少選10個皮髓交界部視野觀察。

5.免疫組織化學法檢測 采用免疫組織化學法檢測腎內(nèi)炎性因子IL-1β的表達。使用SABC法，一抗為兔抗大鼠IL-1β單克隆抗體(1∶200)。用JD-801計算機圖像分析系統(tǒng)分析各目的蛋白的半定量表達水平。每張切片上隨機選取6個視野，以平均吸光度計算蛋白表達量。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、各組大鼠腎組織NOD-2、NF-κB、caspase-1蛋白相對表達量比較

與Sham組相比，I/R組大鼠腎組織NOD2、NF-κB、caspase-1蛋白表達均增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與I/R組相比，I/R+Apocynin組和I/R+DPI組NOD2、NF-κB、caspase-1蛋白表達均減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(圖1)

注：Sham為假手術(shù)組，I/R為腎臟缺血再灌注組，Apocynin為腎臟缺血再灌注+Apocynin處理組，DPI為腎臟缺血再灌注+DPI處理組；與sham組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05圖1 各組大鼠腎組織NOD-1、NF-κB、caspase-1蛋白相對表達量比較

二、各組大鼠腎組織NOD2 mRNA相對表達量比較

與Sham組相比，I/R組大鼠腎組織NOD2 mRNA表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與I/R組相比，I/R+Apocynin組、I/R+DPI組的大鼠腎組織NOD2 mRNA表達均減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(圖2)

注：Sham為假手術(shù)組，I/R為腎臟缺血再灌注組，Apocynin為腎臟缺血再灌注+Apocynin處理組，DPI為腎臟缺血再灌注+DPI處理組；與sham組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05圖2 各組大鼠腎組織NOD2 mRNA相對表達量比較

三、各組大鼠腎臟病理情況比較

與sham組比較，I/R組腎小管損傷程度評分較高(P<0.05)，HE染色下顯示腎小管上皮細胞水腫、壞死，脫落于管腔，腎小管管腔擴大，腎間質(zhì)有炎性細胞浸潤程度明顯增大；與I/R組比較，I/R+Apocynin組、I/R+DPI組腎小管損傷程度評分較低(P<0.05)，HE染色顯示急性腎小管壞死程度減輕。(圖3)

注：Sham為假手術(shù)組，I/R為腎臟缺血再灌注組，Apocynin為腎臟缺血再灌注+Apocynin處理組，DPI為腎臟缺血再灌注+DPI處理組；與sham組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05圖3 各組大鼠腎臟病理情況比較(HE，×200) A.假手術(shù)組；B.I/R組；C.I/R+Apocynin組；D.I/R+DPI組；E.各組腎小管損傷評分

四、各組大鼠腎組織炎性因子IL-1β相對表達量比較

免疫組化結(jié)果顯示，sham組腎組織IL-1β僅少量炎性因子IL-1β表達；與sham組相比，I/R組大鼠腎組織IL-1β表達明顯增加(P<0.05)；與I/R組相比，I/R+Apocynin組、I/R+DPI組IL-1β表達顯著減少(P<0.05)。(圖4)

注：Sham為假手術(shù)組，I/R為腎臟缺血再灌注組，Apocynin為腎臟缺血再灌注+Apocynin處理組，DPI為腎臟缺血再灌注+DPI處理組；與sham組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05圖4 各組大鼠腎組織IL-1β相對表達量比較 A.假手術(shù)組；B.I/R組；C.I/R+Apocynin組；D.I/R+DPI組；E.各組IL-1β蛋白表達量

討 論

腎臟IRI是一種復雜的病理生理事件，是AKI最常見原因。在IRI中，氧化應激是誘導組織損傷的關(guān)鍵致病機制。正常情況下，細胞中氧化劑和抗氧化劑的產(chǎn)生之間處于平衡狀態(tài)。當氧化劑產(chǎn)生增加，內(nèi)源性抗氧化劑耗盡，可導致細胞損傷、蛋白質(zhì)功能障礙、DNA及脂質(zhì)的損害[5]。在IRI中，氧化應激直接產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，當ROS產(chǎn)生超過機體抗氧化能力時，可氧化破壞生物分子和生物膜，誘導腎小管細胞損傷[6]。NADPH氧化酶(NOX)是產(chǎn)生ROS的重要來源，NOX催化電子從NADPH轉(zhuǎn)移到分子氧，通過NOX催化亞基，產(chǎn)生ROS，參與機體生理和病理生理過程[7]。在幾種IRI模型中使用ROS清除劑可導致組織損傷程度顯著降低[8-9]。本課題組前期研究也證明，使用硫化氫抑制腎臟中NOX2、NOX4的活化，降低ROS產(chǎn)生，可以增加組織抗氧化能力，減輕脂質(zhì)過氧化，從而降低腎臟氧化損傷[10]。

動物的先天免疫主要是通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別疾病相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMPs)實現(xiàn)的。PRR的代表為膜結(jié)合受體(例如Toll樣受體)及胞質(zhì)內(nèi)受體(例如NOD樣受體)。NOD樣受體作為一類新型胞漿內(nèi)的固有免疫模式識別受體，在自身免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，它可識別細菌肽聚糖，活化NF-κB、caspase，誘導多種炎癥因子及趨化因子的分泌，從而介導炎癥反應[11]。NOD2在小鼠腎小管上皮細胞、系膜細胞和足細胞及人的腎小管上皮細胞、腎小球內(nèi)皮細胞上都有表達[4,12]。有研究表明，在腎臟IRI中，腎小管上皮細胞NOD2受體表達增多，引起NF-κB、caspase-1活化，導致IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生，從而誘導細胞死亡信號，加重腎臟的損傷[4]。

而本實驗結(jié)果顯示，在腎臟IRI模型大鼠中，檢測到NOD2蛋白、NOD2 mRNA表達、NF-κB、caspase-1、炎癥介質(zhì)IL-1β表達均增高，腎組織損傷嚴重，說明在IRI時，可能通過激活NOD2信號通路，活化NF-κB，誘導炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，導致AKI。這與已有的研究結(jié)果相似[4]。有研究表明，NOX可作為IRI的治療靶標，使用抗氧化劑可減輕腎臟IRI[13]。阻斷特異性PRR(如TLR2、NOD1、NOD2)對缺血性腎小管上皮細胞損傷有非常顯著的保護作用[14]。本實驗結(jié)果顯示，給予NOX抑制劑Apocynin和DPI處理后，大鼠NOD2、NF-κB、caspase-1、炎癥介質(zhì)IL-1β的表達較I/R組減少，腎小管病理損傷也明顯減輕，說明抑制氧化應激可阻斷NOD2樣受體依賴的炎癥途徑，抑制NF-κB蛋白的產(chǎn)生，減少炎癥介質(zhì)的分泌，減輕IRI過程，這可以為腎臟IRI治療提供新的理論依據(jù)。