CNAS-GL039驗證HCV-RNA定量檢測系統(tǒng)*

黃 靜，李俊如，張 帥

四川省西昌市涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院檢驗科，四川西昌 615000

丙型肝炎病毒(HCV)的全球感染率達3%，其感染后引起的丙型病毒性肝炎為常見的感染性疾病，控制不佳還可發(fā)展為肝衰竭，嚴重影響患者健康。HCV感染1周內(nèi)人體內(nèi)就可檢測出HCV-RNA，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)定性檢測HCV-RNA可用于HCV感染的早期診斷,解決了免疫學(xué)檢測的“窗口期”問題。此外，定量檢測HCV-RNA的拷貝數(shù)，對動態(tài)監(jiān)測HCV的傳染性、病毒復(fù)制情況、抗病毒藥物療效及判斷患者預(yù)后等有著重要的臨床意義[1]。因此，HCV-RNA檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性顯得尤為重要。臨床PCR實驗操作煩瑣，影響檢測結(jié)果的因素較多，為評估檢測系統(tǒng)性能，保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確，進一步完善實驗室質(zhì)量控制體系，本研究參照中國合格評定國家認可委員會(CNAS)-GL039[2]對HCV-RNA定量檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確度、精密度(重復(fù)性和中間精密度)和線性區(qū)間進行了分析驗證，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機收集HCV感染者HCV-RNA水平為107、102IU/mL的血清標(biāo)本(無溶血、脂血、黃疸)各15 mL，充分混勻后各取300 μL分裝至滅菌EP管內(nèi)，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2儀器與試劑 湖南圣湘生物科技有限公司生產(chǎn)的稀釋用小牛血清；原衛(wèi)生部臨床檢驗中心第二次室間質(zhì)評標(biāo)本：1721、1722、1723、1724、1725；北京康徹思坦公司提供的HCV-RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：103、104IU/mL的血清標(biāo)本(批號：201708003、201706001)；核酸提取儀 (湖南圣湘，型號：S11A)；ABI公司生產(chǎn)的實時熒光定量PCR擴增儀(ABI75000，批號：275051447)；丙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光探針法)(湖南圣湘,批號：2017031)。

1.3方法

1.3.2線性驗證 將HCV-RNA水平為107IU/mL的血清標(biāo)本作為初始標(biāo)本，用小牛血清依次以10倍水平梯度稀釋至106、105、104、103、102IU/mL，稀釋當(dāng)天每份標(biāo)本檢測2次，計算每一水平實測值(為測量均值)，排除離群值。以稀釋倍數(shù)為橫軸,每個稀釋倍數(shù)所對應(yīng)的實測值為縱軸進行線性回歸分析,求出回歸方程Y=aX+b和相關(guān)系數(shù)的平方(R2)，如果R2>0.95，則可以初步判斷廠家提供的線性范圍符合要求。根據(jù)線性回歸方程求出每一稀釋倍數(shù)符合線性方程的理論值，計算每一稀釋倍數(shù)實測值和理論值間的差異[4]，實測值與理論值均用對數(shù)形式表示。以能力驗證/室間質(zhì)評評價界限(靶值±2/5對數(shù)值)作為TEa[5]。

1.3.3準(zhǔn)確度驗證 檢測室間質(zhì)評標(biāo)本1721、1722、1723、1724、1725，并將實測值與CANS認可的原衛(wèi)生部臨床檢驗中心提供的PT項目結(jié)果(HCV-RNA)進行對比，使用PT項目時應(yīng)不少于5份[3]。以能力驗證/室間質(zhì)評評價界限(靶值±2/5對數(shù)值)作為TEa[5]。實測值與靶值均用對數(shù)形式表示。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，建立線性回歸方程判斷線性范圍是否符合要求。

2 結(jié) 果

2.1精密度驗證 HCV-RNA 107、102IU/mL兩水平標(biāo)本的實驗室內(nèi)s分別為0.047 9、0.033 5，滿足重復(fù)性<3/5TEa(0.24)的要求，見表1。HCV-RNA 103、104IU/mL兩水平室內(nèi)質(zhì)控品2018年1-6月的s分別為0.09、0.09，滿足中間精密度<4/5TEa(0.32)的要求，見表2。

表1 HCV-RNA重復(fù)性驗證結(jié)果

2.2線性驗證 線性回歸方程為Y=-0.995 7X+ 8.376 7，R2=0.999 6，初步判斷線性范圍符合要求。每一稀釋倍數(shù)實測值和理論值的差異均滿足TEa要求，見表3。

表2 HCV-RNA中間精密度驗證結(jié)果

表3 HCV-RNA線性驗證結(jié)果

2.3準(zhǔn)確度驗證 將實測值與PT項目(HCV-RNA)結(jié)果進行對比，均滿足TEa要求，見表4。

表4 準(zhǔn)確度驗證結(jié)果

3 討 論

實時熒光定量PCR檢測技術(shù)以其高靈敏度、高特異度、全封閉單管擴增等優(yōu)勢逐漸在各臨床實驗室中被廣泛使用。目前尚無權(quán)威機構(gòu)發(fā)布分子診斷相關(guān)的檢驗程序性能驗證的具體解釋和指導(dǎo)意見，為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠，有大量文獻進行了自建性能驗證方法探討[6-9]。2019年2月15日CNAS首次發(fā)布CNAS-GL039《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[2]，本實驗室依據(jù)CNAS-GL039標(biāo)準(zhǔn)對HCV-RNA定量檢測系統(tǒng)的性能進行了分析驗證。

線性是反映實驗室方法性能的重要指標(biāo)之一，可反映分析物水平或活性與分析檢測系統(tǒng)之間相應(yīng)的比例關(guān)系，在臨床醫(yī)生認為有價值的分析檢測范圍內(nèi)實驗方法呈線性，了解分析結(jié)果與真值之間的偏差，才能保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究HCV-RNA稀釋倍數(shù)與實測值的線性回歸方程為Y=-0.995 7X+8.376 7，R2>0.95，每一稀釋倍數(shù)對應(yīng)的實測值和計算理論值的差異均滿足TEa要求，可以初步判斷廠家提供的線性范圍符合要求，滿足臨床需要。

基因擴增檢測已被廣泛應(yīng)用于臨床、科研工作，基因擴增檢測受基質(zhì)效應(yīng)、基因變異等多種因素影響，各試劑廠家實驗方法不同，因此檢測靈敏度、特異度差異較大。分子診斷中很多實驗缺乏參考方法，難于校準(zhǔn)，因此實驗室將室間質(zhì)評作為室內(nèi)質(zhì)控的有效補充，目前是分子診斷質(zhì)量保證中不可或缺的部分。本研究將此次驗證檢測的室間質(zhì)評標(biāo)本的結(jié)果與原衛(wèi)生部臨床檢驗中心的PT項目(HCV-RAN)結(jié)果對比，準(zhǔn)確度滿足能力驗證要求。

綜上所述，CNAS-GL039為分子實驗室完善質(zhì)量控制體系提供了切實可行的依據(jù)。根據(jù)CNAS-GL039對實驗室HCV-RNA定量檢測系統(tǒng)進行性能驗證結(jié)果顯示，該檢測系統(tǒng)在一定范圍內(nèi)進行HCV-RNA檢測的結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于臨床實驗室。