赤峰地區(qū)蒙古族冠心病患者CYP2C19基因多態(tài)性分布研究*

陳曉梅，李樹敏，韓旭晨，霍昱吉，李 靜，陳士萍△

赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.心內(nèi)科，內(nèi)蒙古赤峰 024005

冠心病是最常見的心血管疾病，其發(fā)病機(jī)制為冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化引起血管狹窄、痙攣或阻塞，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧、壞死[1]。經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(PCI)是冠心病的首選治療方法，能快速、有效地改善心肌血供[2]。PCI治療后需進(jìn)行抗凝治療以預(yù)防血栓形成，氯吡格雷是臨床上廣泛使用的抗凝藥物，但其發(fā)揮藥物作用需要P450酶的輔助。CYP2C19基因?qū)儆诩?xì)胞色素P450酶第二亞家族[3]，其不同的基因表型可對氯吡格雷的代謝產(chǎn)生影響，掌握CYP2C19基因多態(tài)性的分布情況對冠心病患者抗凝藥物的選擇具有重要意義。部分學(xué)者認(rèn)為CYP2C19基因的多態(tài)性應(yīng)在藥物使用期間進(jìn)行檢測，以避免不良心血管事件的發(fā)生[4-6]。本文通過分析赤峰地區(qū)蒙古族冠心病患者CYP2C19基因多態(tài)性的分布情況，以期為臨床個體化用藥提供依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3-12月于本院確診為冠心病并行PCI治療的患者558例為研究對象，其中蒙古族患者299例為研究組，漢族患者259例為對照組。研究組中男165例，女134例；年齡35.3～79.4歲，中位年齡54.2歲；所有蒙古族患者間無血緣關(guān)系。對照組中男146例，女113例；年齡39.7～68.2歲，中位年齡48.3歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)；同意加入本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嚴(yán)重心臟疾病者，如嚴(yán)重心力衰竭、心律失常等；合并嚴(yán)重呼吸、消化系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤者；有精神障礙者。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 血液標(biāo)本基因組DNA提取試劑盒(凱普生物公司)；CYP2C19基因檢測試劑盒(武漢海吉力生物科技公司)；基因擴(kuò)增儀ABI7500(ABI公司)。

1.3檢測方法

1.3.1DNA提取 取200 μL抗凝全血標(biāo)本，加入20 μL蛋白酶K，加入溶液L震蕩，56 ℃混勻，溫浴15～20 min，期間顛倒混勻；加入200 μL無水乙醇，充分混勻后將液體轉(zhuǎn)入帶有硅膠柱的2 mL離心管中，10 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液；將離心柱放入收集管中，在硅膠柱中加入500 μL溶液W1(使用前檢查是否加入無水乙醇)，10 000 r/min離心1 min；將離心柱再放入收集管中，在硅膠柱中加入500 μL溶液W2，10 000 r/min離心1 min；將離心柱再次放入收集管中，12 000 r/min離心3 min，倒掉收集管中的廢液；將吸附柱放入新的1.5 mL離心管中,開蓋靜置1～2 min后，向吸附柱中加入100 μL的TE洗脫液，靜置2～5 min，12 000 r/min離心2 min；棄柱得DNA；將所得DNA分裝入1～6號管，依次加入6聯(lián)PCR反應(yīng)條(*1G、*1A、*2G、*2A、*3G、*3A)。每個單管中的DNA最佳上樣量為10 μL，每次實(shí)驗(yàn)均加入陰性及陽性對照。

1.3.2ABI7500循環(huán)反應(yīng)條件 95 ℃ 5 min,1個循環(huán)；95 ℃ 0.05 s ，58 ℃ 30 s,10個循環(huán)；95 ℃ 0.05 s， 58 ℃ 30 s,35個循環(huán)；收集信號 72 ℃ 30 s；選擇FAM熒光。

1.3.3DNA質(zhì)量檢測 將提取好的DNA標(biāo)本用紫外線分光光度計(jì)檢測DNA的水平和質(zhì)量。DNA的水平要求≥10 ng/μL，DNA的質(zhì)量A260/280在1.8～2.0。將符合要求的DNA用TE稀釋到0.1～20 ng/μL，要求最終加入6聯(lián)PCR反應(yīng)條中每個單管中的DNA總量為1～200 ng，最佳上樣量為20～50 ng。

1.3.4CYP2C19基因多態(tài)性結(jié)果判定 選擇1、2管根據(jù)野生型和突變型FAM信號Ct值判斷標(biāo)本CYP2C19*1的基因多態(tài)性；選擇3、4管根據(jù)野生型和突變型FAM信號Ct值判斷標(biāo)本CYP2C19*2的基因多態(tài)性；選擇5、6管根據(jù)野生型和突變型FAM信號Ct值判斷標(biāo)本CYP2C19*3的基因多態(tài)性，見表1。Ct值的確定使用自動設(shè)置基線，手動設(shè)置閾值線，同時選擇陽性對照反應(yīng)孔，可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)至FAM擴(kuò)增曲線升起的拐點(diǎn)處，得到Ct值。陽性對照分析，1～6號管陽性對照FAM信號的Ct值一般小于25，波動范圍在15～25。

表1 CYP2C19基因多態(tài)性結(jié)果判定

1.4觀察指標(biāo) 比較兩組患者CYP2C19基因型分布情況；比較兩組患者CYP2C19基因代謝型分布情況，其中代謝能力快的基因型為CYP2C19*1/*1，代謝能力慢的基因型為CYP2C19*2/*2、*2/*3、*3/*3，代謝能力居中的基因型為CYP2C19*1/*2、*1/*3。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組CYP2C19基因型分布情況比較 研究組CYP2C19*1/*1、*1/*2、*2/*3型所占比例均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組CYP2C19*1/*3、*2/*2、*3/*3型所占比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究組與對照組中均以CYP2C19*1/*2型所占比例最高。見表2。

表2 兩組CYP2C19基因型分布情況比較[n(%)]

2.2兩組CYP2C19基因代謝型分布情況比較 研究組中間代謝型和慢代謝型基因所占比例低于對照組，快代謝型基因所占比例高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

3 討 論

CYP2C19基因與氯吡格雷、S-甲莫芬、奧美拉唑、伏立康唑、地西泮等藥物的代謝相關(guān)[7]。CYP2C19基因變異可導(dǎo)致個體酶活性的差異，使群體中出現(xiàn)超快代謝者、快代謝者、中間代謝者和慢代謝者4種表型，其中超快代謝者攜帶CYP2C19*1/*17和CYP2C19*17/*17基因，快代謝者攜帶CYP2C19*1/*1基因，中間代謝者攜帶CYP2C19*1/*2、*1/*3基因，慢代謝者攜帶CYP2C19*2/*2、*2/*3、*3/*3基因[5]。不同基因表型人群對藥物的代謝能力不同，引起同一藥物在不同人群中的藥效差別。其中中間代謝者與慢代謝者需適當(dāng)增加藥物的使用劑量才能達(dá)到與超快代謝者或快代謝者相同的治療效果[6-8]。

本研究中，漢族冠心病患者CYP2C19基因型分布情況：CYP2C19*1/*2型占比最高，為39.8%，CYP2C19*1/*1型為34.4%，CYP2C19*1/*3型為11.2%，CYP2C19*2/*2型為13.1%，CYP2C19*2/*3型、*3/*3型所占比例最低，僅為0.8%。與國內(nèi)一些學(xué)者所研究的黑龍江、重慶等地區(qū)漢族人群CYP2C19基因分布情況基本相似[7,9]，說明我國不同地區(qū)漢族人群存在基因多態(tài)性分布相對一致的現(xiàn)象。

CYP2C19基因多態(tài)性具有顯著的種族差異。CYP2C19*2基因在非裔美國人和中國人中的發(fā)生率分別為17.0%、30.0%，CYP2C19*3基因的發(fā)生率分別為0.4%、5.0%；高加索人和中國人中慢代謝型基因的發(fā)生率分別為3.0%、15.0%～17.0%[10]。本研究對漢族與蒙古族冠心病患者CYP2C19的基因型分布進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，蒙古族患者CYP2C19*1/*1、*1/*2、*2/*3型所占比例均高于漢族患者(P<0.05)。兩民族CYP2C19基因代謝型分布情況比較，結(jié)果顯示，兩民族患者均以中間代謝型所占比例最高，其次為快代謝型，慢代謝型所占比例最低；且蒙古族患者快代謝型基因所占比例高于漢族患者(P<0.05)，慢代謝型和中間代謝型基因所占比例低于漢族患者(P<0.05)?？紤]兩民族之間CYP2C19基因型差異可能與遺傳、生活方式等多種因素相關(guān)[10]。此外，臨床上對中間代謝型或慢代謝型冠心病患者進(jìn)行抗凝治療時，可通過適當(dāng)增加氯吡格雷的劑量或選用第3代血小板抑制劑來達(dá)到預(yù)期治療效果[2]。

雖然CYP2C19基因型的檢測可以針對性地指導(dǎo)個體用藥，但目前基因檢測費(fèi)用較高，臨床上并不能對所有需使用氯吡格雷等受CYP2C19基因型影響的藥物的患者進(jìn)行基因檢測來指導(dǎo)藥物的使用劑量，所以探索更為簡便、費(fèi)用低廉的檢測方法仍是目前亟待解決的問題。

綜上所述，赤峰地區(qū)蒙古族冠心病患者CYP2C19基因存在不同的基因型和代謝型，且與漢族冠心病患者間存在差異，掌握CYP2C19基因的多態(tài)性分布對冠心病患者抗凝藥物的選擇具有重要意義。