藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲雙重熒光定量PCR兩步法檢測技術(shù)的建立

李 佳，黃達娜，張曉敏，牛 叢，萬成松，張仁利1,

藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia)(賈第蟲)和微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)，簡稱“兩蟲”，是兩種常見的寄生于人與動物腸道的原蟲，分別引起賈第蟲病和隱孢子蟲病，主要通過糞口途徑傳播，嚴重時可導致死亡[1]。藍氏賈第鞭毛蟲主要寄生在宿主小腸，主要是十二指腸，可引起腹痛、腹瀉及吸收不良等癥狀。每年全球大約有2億人感染藍氏賈第鞭毛蟲，在旅游者中發(fā)病率較高，因此由藍氏賈第鞭毛蟲引起的腹瀉也稱為“旅游者腹瀉”[2-3]。微小隱孢子蟲是專性細胞內(nèi)寄生原蟲，主要寄生于小腸上皮細胞的刷狀緣納蟲空泡內(nèi)，引起宿主腹瀉、腹痛，病程多為自限性。免疫缺陷患者的癥狀更為嚴重，多并發(fā)腸外器官隱孢子蟲病，微小隱孢子蟲感染也是艾滋病患者并發(fā)腹瀉死亡的原因之一[4-5]。WHO將隱孢子蟲病和賈第蟲病列為重要的人獸共患寄生蟲病[6]；2006年，我國將“兩蟲”列為《生活飲用水衛(wèi)生標準》的非常規(guī)項目[7]。因此，建立“兩蟲”的同步定量檢測方法具有重要的意義。目前，“兩蟲”的檢測方法主要包括鏡檢法、免疫學方法、分子生物學方法等。傳統(tǒng)的鏡檢法是“兩蟲”檢測的“金標準”，但耗時耗力，且檢出率較低[8]。免疫學方法，如免疫熒光、ELISA，雖然靈敏度和特異性較傳統(tǒng)的鏡檢法有所提高，但前者不能區(qū)分蟲種，后者易出現(xiàn)交叉反應，不能準確定量，在輕度感染的糞便樣本中的應用較差[9]。熒光定量PCR(FQ-PCR)法敏感性高，特異性好，能同時檢測大量樣本，是同時定量檢測“兩蟲”的首選方法之一。本研究旨在建立TaqMan探針的雙重熒光定量PCR檢測方法，以實現(xiàn)“兩蟲”靈敏快速的臨床檢測。

1 材料與方法

1.1蟲體及醫(yī)源性腹瀉樣本 藍氏賈第鞭毛蟲、微小隱孢子蟲、異尖線蟲、弓形蟲、肝吸蟲、瘧原蟲和廣州管圓線蟲均分離自深圳市疾病預防控制中心寄生蟲門診部病人的留存樣本，由深圳市疾病預防控制中心病原生物所實驗室保存。疑似“兩蟲”感染病人的醫(yī)源性腹瀉樣本均來自深圳市疾病預防控制中心寄生蟲門診部。

1.2試劑與儀器 主要試劑：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、pMDTM19-T載體、Ex Taq?Hot Start Version購自寶生物工程有限公司；切膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit、DNA提取試劑盒DNeasy Blood & Tissue Kit和QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit購自QIAGEN公司；質(zhì)粒提取試劑盒E.Z.N.A.?Plasmid Midi Kit購自O(shè)MEGA公司。主要儀器：ABI7500熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1引物和TaqMan探針的設(shè)計和合成 在GenBank中查找微小隱孢子蟲cowp基因序列(GenBank序列號：AB514064.1)和藍氏賈第鞭毛蟲gdh基因序列(GenBank序列號：KM190761.1)，根據(jù)其保守區(qū)域，用Primer Express 3.0軟件設(shè)計引物和探針，并對所設(shè)計的引物和探針在NCBI上進行Blast比對，藍氏賈第鞭毛蟲探針5’端標記VIC熒光基團，微小隱孢子蟲5’端標記FAM熒光基團(表1)。引物和探針在生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR的引物和TaqMan探針
Tab.1 Primer and TaqMan probe for FQ-PCR

Target SpeciesGenePrimer/probeSequence(5'-3')Length/bpGiardia lambliagdhGIA-FACTCCAACGGGACCATTGTC156GIA-RAGCACTCCCAAGGCTTCTTGGIA-PVIC-CAACGAGGAGAAGCTGGCCCACC-BHQ1Cryptosporidium parvumcowpCRY-FTTGCATTCACTATGCCTGAAAAA115CRY-RAGTATAGTGCCTGGAGGACATTCTGCRY-PFAM-CCCCCAGGATTCGTTTTTTCTGGAAA-TAMRA

1.3.2蟲體基因組DNA的提取 醫(yī)源性腹瀉樣本參照試劑盒QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit說明書提取DNA；分離的蟲體參照試劑盒DNeasy Blood & Tissue Kit說明書提取DNA，提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3質(zhì)粒標準品的制備 以引物GIA-F/R對藍氏賈第鞭毛蟲基因組DNA進行PCR擴增，同時以引物CRY-F/R對微小隱孢子蟲基因組DNA進行PCR擴增。普通PCR反應體系總體積為50 μL，體系組分包括：HS Enzyme 0.25 μL、10x EX Taq buffer 5 μL、dNTP 4 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DEPC H2O 35.75 μL、DNA模板3 μL。反應條件為：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。

1%瓊脂糖凝膠電泳后對目的片段進行切膠回收，將回收后的片段連接至pMDTM19-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取單菌落由生工生物工程(上海)有限公司測序驗證。測定濃度后作為質(zhì)粒標準品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4引物和探針濃度的優(yōu)化 根據(jù)ABI7500儀器使用說明書構(gòu)建反應體系，分別對藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲的引物和探針濃度進行優(yōu)化。FQ-PCR反應體系總體積為20 μL，體系組分包括：Premix Ex Taq?(Probe qPCR) 10 μL、上下游引物(GIA-F/R、CRY-F/R)終濃度分別為0.2、0.4和0.6 μmol/L、探針(GIA-P、CRY-P)終濃度分別為0.1、0.2和0.3 μmol/L、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、DNA模板2 μL，DEPC H2O補足體積20 μL。實驗分組如下：第①②③組的探針濃度為0.1 μmol/L，引物濃度分別為0.2、0.4和0.6 μmol/L；第④⑤⑥組的探針濃度為0.2 μmol/L，引物濃度分別為0.2、0.4和0.6 μmol/L；第⑦⑧⑨組的探針濃度為0.3 μmol/L，引物濃度分別為0.2、0.4和0.6 μmol/L。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s(收集熒光)，共40個循環(huán)。熒光定量PCR后通過比較Ct值、ΔRn值和擴增曲線確定最終的引物和探針濃度。

1.3.5雙重FQ-PCR體系的建立 根據(jù)2.4中的結(jié)果確定體系最優(yōu)的引物和探針濃度，構(gòu)建雙重FQ-PCR體系。

1.3.6雙重FQ-PCR體系靈敏度的評價和標準曲線的繪制 以含有藍氏賈第鞭毛蟲目的片段的質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA和含有微小隱孢子蟲目的片段的質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY為模板，進行倍比稀釋使其終濃度為100～109copies/μL，將兩種模板同時加入同一個反應管中，用建立的雙重FQ-PCR體系進行反應，確定其靈敏度，同時以質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.7雙重FQ-PCR體系特異性的評價 分別以藍氏賈第鞭毛蟲、微小隱孢子蟲、質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA、質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY、弓形蟲、異尖線蟲、肝吸蟲、瘧原蟲、廣州管圓線蟲DNA為模板，同時設(shè)立DEPC H2O作為陰性對照，用建立的雙重FQ-PCR體系進行反應，評價其特異性。

1.3.8雙重FQ-PCR體系穩(wěn)定性和重復性的評價

分別選取濃度為109～105copies/μL的藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲質(zhì)粒DNA作為模板，將兩種模板同時加入同一個反應管中，用建立的雙重FQ-PCR體系進行反應，每個濃度進行3次平行實驗，計算其標準差和變異系數(shù)，評價其批內(nèi)穩(wěn)定性。同時在一周內(nèi)選取5 d，分別進行檢測，每次進行3次平行實驗，計算5次結(jié)果的標準差和變異系數(shù)，評價其批間重復性。

1.3.9雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR方法一致性的評價 分別選取濃度為102～108copies/μL的藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲質(zhì)粒DNA作為模板，同時進行雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR檢測，每個濃度進行3次平行實驗，計算其標準差和變異系數(shù)，評價雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR方法的一致性。

1.3.10雙重FQ-PCR體系的實際應用評價 分別將來自寄生蟲門診部的疑似“兩蟲”感染病人的醫(yī)源性腹瀉樣本編號為1～6，分別提取核酸作為模板，使用本研究建立的雙重FQ-PCR體系進行檢測，同時使用商品化金標層析試紙條進行檢測，以評價此體系的實際應用價值。

2 結(jié) 果

2.1標準質(zhì)粒的濃度測定 經(jīng)測定，藍氏賈第鞭毛蟲質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA和微小隱孢子蟲質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY的濃度分別為77.13 ng/μL和66.57 ng/μL。經(jīng)下列公式換算成拷貝數(shù)分別為4.51×1011copies/μL和5.28×1011copies/μL?？截?μL=濃度(ng/μL)×阿伏伽德羅常數(shù)×10-9/(660×堿基數(shù))

2.2引物和探針濃度的優(yōu)化結(jié)果 分別選取濃度為4.51×108copies/μL的藍氏賈第鞭毛蟲質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA和濃度為5.28×108copies/μL的微小隱孢子蟲質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY作為模板，根據(jù)1.3.4所述的實子分組進行引物和探針濃度的優(yōu)化。由圖1和圖2可知，根據(jù)ΔRn值最高、Ct值最低的原則，兩對引物的最優(yōu)濃度均為0.4 μmol/L，兩對探針的最優(yōu)濃度均為0.3 μmol/L。

Note: 1為⑧, 2為⑨, 3為⑦, 4為⑥, 5為④, 6為⑤; 7為①, 8為②, 9為③圖1 藍氏賈第鞭毛蟲特異性引物(GIA-F/R)和探針(GIA-P)的濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization results of Giardia lamblia specific primers and probes

Note: 1為⑧, 2為⑨, 3為⑤, 4為⑥, 5為⑦, 6為④, 7為②, 8為③, 9為①圖2 微小隱孢子蟲特異性引物(CRY-F/R)和探針(CRY-P)的濃度優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization results of Cryptosporidium parvum specific primers and probes

2.3雙重FQ-PCR體系的建立 根據(jù)2.2引物和探針濃度優(yōu)化的結(jié)果，最終確定雙重FQ-PCR體系，體系組分包括：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 10 μL、GIA-F(10 μmol/L) 0.8 μL、GIA-R(10 μmol/L) 0.8 μL、CRY-F(10 μmol/L) 0.8 μL、CRY-R(10 μmol/L) 0.8 μL、GIA-P(10 μmol/L) 0.6 μL、CRY-P(10 μmol/L) 0.6 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、兩蟲DNA模板各2 μL，DEPC H2O補足體積至20 μL。用雙重FQ-PCR體系檢測藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲樣本的結(jié)果見圖3，結(jié)果表明該體系能同時檢測兩蟲或任意一種蟲種。

Note: 1,5: Giardia lamblia; 2,4: Giardia lamblia+Cryptosporidium parvum; 3,6: Cryptosporidium parvum; 7,8: DEPC H2O. Red curve was the VIC detection channel (Giardia lamblia); black curve was the FAM detection channel (Cryptosporidium parvum)圖3 雙重FQ-PCR體系的建立Fig.3 Establishment of duplex FQ-PCR system

2.4雙重FQ-PCR體系的靈敏度和標準曲線 以梯度稀釋后濃度分別為4.51×109copies/μL～4.51×100copies/μL的質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA和5.28×109copies/μL～5.28×100copies/μL的質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY作為模板，以DEPC H2O作為陰性對照，進行雙重FQ-PCR，擴增曲線見圖4，結(jié)果表明該體系對藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲檢測的靈敏度分別為45.1 copies/μL和52.8 copies/μL。以質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果見圖5。雙重FQ-PCR體系檢測藍氏賈第鞭毛蟲的標準曲線方程為：Ct=-3.08×LOG(copies)+41.57，R2=0.99，擴增效率為111%；檢測微小隱孢子蟲的標準曲線方程為Ct=-3.2×LOG(copies)+42.17，R2=0.99，擴增效率為105%。結(jié)果表明該體系在濃度為109copies/μL～101copies/μL之間具有良好的線性關(guān)系。

2.5雙重FQ-PCR體系的特異性 利用雙重FQ-PCR體系同時檢測藍氏賈第鞭毛蟲、微小隱孢子蟲、質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-GIA(濃度為4.51×107copies/μL)、質(zhì)粒DNA pMDTM19-T-CRY(濃度為5.28×107copies/μL)、弓形蟲、異尖線蟲、肝吸蟲、瘧原蟲、廣州管圓線蟲DNA，以DEPC H2O作為陰性對照，擴增曲線見圖6。結(jié)果表明該體系能分別或同時檢測出藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲的DNA，且對其它蟲種DNA檢測結(jié)果均為陰性，體系特異性良好。

Note: The concentration of the plasmid standard from left to right in the amplification curve was 4.51×109 copies/μL～4.51×100 copies/μL(Giardia lamblia) and 5.28×109 copies/μL～5.28×100 copies/μL(Cryptosporidium parvum). The bottom line was DEPC H2O. The blue curve was the FAM detection channel (Cryptosporidium parvum); the red curve was the VIC detection channel (Giardia lamblia)圖4 質(zhì)粒標準品擴增曲線Fig.4 Plasmid standard amplification curve

Note: The blue line is the standard curve of Cryptosporidium parvum; the red line is the standard curve of Giardia lamblia.圖5 雙重FQ-PCR的標準曲線Fig.5 Standard curve of duplex FQ-PCR

Note: 1,9: Plasmid DNA pMDTM19-T-CRY; 2,10: Cryptosporidium parvum; 3,11: Plasmid DNA pMDTM19-T-GIA; 4,12: Giardia lamblia; 5,7: Plasmid DNA pMDTM19-T-CRY+ Plasmid DNA pMDTM19-T-GIA; 6,8: Cryptosporidium parvum+Giardia lamblia; 13,14: Toxoplasma Gondii; 15,16: Anisakis; 17,18: Liver fluke; 19,20: Plasmodium; 21,22: Angiostrongylus cantonensis; 23,24: DEPC H2O. The black curve is the FAM detection channel (Cryptosporidium parvum); the red curve is the VIC detection channel (Giardia lamblia).圖6 雙重FQ-PCR的特異性擴增曲線Fig.6 Specific amplification curve of duplex FQ-PCR

2.6雙重FQ-PCR體系穩(wěn)定性和重復性 雙重FQ-PCR的批內(nèi)穩(wěn)定性實驗見表2，結(jié)果顯示，藍氏賈第鞭毛蟲質(zhì)粒DNA每個稀釋度的3個平行反應管Ct值的變異系數(shù)均在1.16%以下；微小隱孢子蟲質(zhì)粒DNA每個稀釋度的3個平行反應管Ct值的變異系數(shù)均在0.62%以下，證明該體系檢測兩蟲的批內(nèi)穩(wěn)定性良好。雙重FQ-PCR的批間重復性實驗見表3，結(jié)果表明，藍氏賈第鞭毛蟲質(zhì)粒DNA每個稀釋度5次實驗中，3個平行反應管Ct值的變異系數(shù)均在3.81%以下；微小隱孢子蟲質(zhì)粒DNA每個稀釋度5次實驗中，3個平行反應管Ct值的變異系數(shù)均在3.39%以下，證明該體系檢測兩蟲的批間重復性良好。

2.7雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR方法的一致性

雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR方法一致性實驗結(jié)果見表4，兩種方法檢測微小隱孢子蟲Ct值的變異系數(shù)在2.21%以下；檢測藍氏賈第鞭毛蟲Ct值的變異系數(shù)在1.60%以下，證明該體系與單重FQ-PCR檢測結(jié)果具有較好的一致性。

表2 雙重FQ-PCR的批內(nèi)穩(wěn)定性
Tab.2 Intra-assay stability of duplex FQ-PCR

SpeciesConcentration(copies/μL)Ct value123x±sCV(%)Cryptosporidium parvum5.28×10910.5310.5210.4310.49±0.040.385.28×10813.5613.6013.7213.63±0.070.515.28×10717.8717.7817.7117.79±0.070.395.28×10621.3121.1220.9821.13±0.130.625.28×10524.5524.3724.2324.38±0.130.53Giardia lamblia4.51×10911.3211.2011.0211.18±0.131.164.51×10814.7515.0614.8214.88±0.130.874.51×10718.8118.5518.8218.73±0.130.694.51×10622.2122.1122.4622.26±0.150.674.51×10525.5125.9025.8025.74±0.170.66

表3 雙重FQ-PCR的批間重復性
Tab.3 Inter-assay repeatability of duplex FQ-PCR

SpeciesConcentration(copies/μL)Ct value12345x±sCV(%)Cryptosporidium parvum5.28×10910.4410.499.9510.839.9210.33±0.353.395.28×10813.6313.6314.8513.8913.6613.93±0.473.375.28×10717.9017.7919.2718.0718.5918.32±0.553.005.28×10621.0321.1321.0821.3821.7421.28±0.261.225.28×10524.2724.3825.1025.1825.2724.84±0.421.69Giardia lamblia4.51×10911.1611.2110.1911.3511.1811.02±0.423.814.51×10814.3714.5015.5214.8214.8814.82±0.402.704.51×10718.2218.3418.3318.4718.7318.42±0.170.924.51×10621.4421.5321.3522.0722.2621.73±0.361.664.51×10524.7825.1225.4725.6925.7425.36±0.361.42

2.8雙重FQ-PCR體系的實際應用評價 雙重FQ-PCR體系對來自寄生蟲門診部的疑似“兩蟲”感染病人的醫(yī)源性腹瀉樣本所提取的核酸的檢測結(jié)果見圖7，結(jié)果顯示，此方法不僅能有效地檢測出藍氏賈第鞭毛蟲或微小隱孢子蟲陽性樣本的核酸，且互不干擾，還能同時檢測出“兩蟲”陽性樣本的核酸。與此同時，我們同時用現(xiàn)有商品化的金標層析法檢測了樣本，并與本實驗所建立的雙重FQ-PCR方法進行比較，結(jié)果見表5，結(jié)果顯示兩種方法檢測樣本的符合率為100%，表明此體系有較好的實際應用價值。

Note: 1,11: sample 1; 2,12: sample 3; 3,6: sample 2+sample 3; 4,13: sample 4; 5,14: sample 2; 7,9: sample 4+sample 5; 8,15: sample 5; 10,16: sample 6; 17,18: DEPC H2O. The orange curve is the FAM detection channel (Cryptosporidium parvum); the green curve is the VIC detection channel (Giardia lamblia).圖7 雙重FQ-PCR的實際應用評價Fig.7 Practical evaluation of duplex FQ-PCR

表4 雙重FQ-PCR和單重FQ-PCR方法的一致性
Tab.4 Consistency of duplex FQ-PCR and single FQ-PCR methods

Cryptosporidium parvumGiardia lambliaConcentration(copies/μL)Mean of duplex FQ-PCR Ct valueMean of single FQ-PCR Ct valuex±sCV(%)Concentration(copies/μL)Mean of duplex FQ-PCR Ct valueMean of single FQ-PCR Ct valuex±sCV(%)5.28×10814.6515.2014.93±0.281.874.51×10814.7515.0614.90±0.161.075.28×10717.0417.7717.40±0.372.124.51×10717.4917.7517.62±0.130.745.28×10620.5221.3520.94±0.422.004.51×10620.8821.2221.05±0.170.815.28×10523.7824.5924.18±0.401.664.51×10523.9224.6924.31±0.391.605.28×10427.3928.6228.01±0.622.214.51×10427.6727.9027.79±0.110.405.28×10330.5931.6431.11±0.531.704.51×10330.5731.1230.84±0.280.915.28×10232.8434.0033.42±0.581.734.51×10233.8633.8133.83±0.030.09

表5 疑似“兩蟲”感染的醫(yī)源性腹瀉樣本兩種檢測方法的比較
Tab.5 Comparison of two detection methods for iatrogenic diarrhea samples suspected of "two insects" infection

樣本編號(Sample number)金標免疫層析法(gold immunochromat ographic assay)雙重熒光定量PCR法(duplex FQ-PCR)Giardia lambliaCryptosporidium parvumGiardia lambliaCryptosporidium parvum符合率(%)(Compliance rate)1+-+(Ct:26.2497)-1002-+-+(Ct:31.292)1003+-+(Ct:26.9952)-1004+-+(Ct:31.1229)-1005-+-+(Ct:33.5769)1006-+-+(Ct:34.5051)1002+3+++(Ct:27.9262)+(Ct:32.2412)1004+5+++(Ct:32.3277)+(Ct:33.6856)100

3 討 論

自20世紀以來，藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲在全球范圍內(nèi)均有報道，每年感染“兩蟲”的患者約200萬例[10]。發(fā)達國家中微小隱孢子蟲感染率約為0.1%～9.1%，藍氏賈第鞭毛蟲感染率約為0.2%～29.2%；而在我國微小隱孢子蟲感染率約為0.3%～16.1%，藍氏賈第鞭毛蟲感染率約為0.4%～16.2%[11-12]。近年來“兩蟲”的感染形式愈發(fā)嚴峻，其宿主廣泛，進入人體后會造成嚴重的健康損害，感染動物后會造成畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟損失。因此，建立一種快速、準確、特異的“兩蟲”檢測方法是具有重要意義的。

相比于傳統(tǒng)的鏡檢法、免疫學方法等，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)以其準確性高、特異性強、重復性好等優(yōu)點，已經(jīng)成為分子生物學領(lǐng)域內(nèi)應用越來越廣泛的技術(shù)之一，也是“兩蟲”檢測的首選方法之一。多重PCR通過使用一對以上引物同時識別一個以上靶序列，在一個反應中同時擴增多個靶序列，在提高通量的同時降低反應成本[13]，早在1988年Chamberian[14]就首次采用了多重PCR技術(shù)；楊曉華等[15]曾建立分別檢測藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲的FQ-PCR方法；Shin等[16]建立了同時檢測微小隱孢子蟲、環(huán)孢子蟲和藍氏賈第鞭毛蟲的多重FQ-PCR方法，方法檢測前兩者的靈敏度為2×101copies/μL，而檢測藍氏賈第鞭毛蟲的靈敏度為2×103copies/μL；高宇航等[17]建立了實驗用羊十二指腸賈第蟲與微小隱孢子蟲雙重PCR檢測方法，該方法最低可檢測每克樣品中5×102個十二指腸賈第蟲和微小隱孢子蟲的包(卵)囊。在本實驗中，我們選取常用于分離鑒定寄生蟲的基因作為靶基因：微小隱孢子蟲的卵囊壁蛋白(cowp)和藍氏賈第鞭毛蟲的谷氨酸脫氫酶(gdh)基因[18-19]；采用FAM和VIC作為熒光報告基團；同時設(shè)計了“變性—退火延伸”兩步法進行PCR擴增，整個過程僅需55 min，在提高反應通量的同時縮短反應時間。本研究建立的以TaqMan探針為基礎(chǔ)的雙重FQ-PCR檢測體系不僅能在同一反應管中同時檢測“兩蟲”，而且具有良好的特異性和靈敏性。“兩蟲”檢測的靈敏度分別為4.51×10 copies/μL和5.28×10 copies/μL，穩(wěn)定性和重復性均在3.81%以下。同時我們通過檢測疑似“兩蟲”感染的醫(yī)源性腹瀉樣本，對建立的FQ-PCR體系和現(xiàn)已商品化的金標層析法進行比較，結(jié)果表明兩種具有較好的一致性，體現(xiàn)了建立的FQ-PCR體系較好的實際應用價值。

綜上，本研究建立的雙重FQ-PCR技術(shù)靈敏度高，特異性強，穩(wěn)定性和重復性好，可用于“兩蟲”快速、特異、準確的定量檢測。

利益沖突：無

引用本文格式：李佳， 黃達娜， 張曉敏，等.藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲雙重熒光定量PCR兩步法檢測技術(shù)的建立[J].中國人獸共患病學報，2020，36(1):32-39. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00. 191