人牙髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞表型及生長特性分析

龐真貞 李碩 劉欽贊 李曄 王良

牙周膜干細(xì)胞是從牙周膜組織中分離出的干細(xì)胞，是牙周組織功能首選中西細(xì)胞，具有自我更新能力，可分化為牙骨質(zhì)、牙周膜以及牙槽骨[1,2]。傳統(tǒng)的牙周病治療主要是消除病因，難以修復(fù)已喪失的牙周組織。牙髓干細(xì)胞具有多向分化的潛能，它除了能形成礦化結(jié)節(jié)能力的細(xì)胞外，經(jīng)過不同細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，還能夠分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、血管內(nèi)皮、肝、神經(jīng)等細(xì)胞系類型[3,4]。牙髓組織位于牙齒內(nèi)部的牙髓腔內(nèi)，是牙體組織中唯一的軟組織[5]。通過對人牙髓細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)了一種與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有著極其相似的免疫表型及形成礦化結(jié)節(jié)能力的細(xì)胞，細(xì)胞中形態(tài)呈梭形，可自我更新和多向分化，有較強(qiáng)的克隆能力[3]。這些由牙髓組織中分離出的成纖維狀細(xì)胞稱為牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells)。目前認(rèn)為牙周膜干細(xì)胞與牙髓干細(xì)胞是口腔乃至全身多種組織再生極有應(yīng)用前景的兩種間充質(zhì)干細(xì)胞，本文分析2種干細(xì)胞的表型及生長特性。

1 材料與方法

1.1 材料 2018年7至12月選擇18～25歲因正畸拔除完整第三磨牙10顆。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：牙齒健康，雙尖牙或第三磨牙，患者對治療知情同意，對本研究也知情同意。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：合并根尖病，齲齒，牙周病。

1.3 試劑與儀器 20%胎牛血清，DMEM，細(xì)胞篩網(wǎng)。

1.4 干細(xì)胞純化擴(kuò)增方法[6]

1.4.1 牙周膜干細(xì)胞：拔除后置入含3倍抗體的PBS液中，在超凈臺(tái)，用PBS液從牙根到牙冠方向沖洗5次，清除血污，滅菌手術(shù)刀片刮根中下1/3牙周膜組織，置入離心管，加消化液，37℃下消化30 min，每5分鐘搖晃離心管1次。加2 ml含20%胎牛血清，1 000 r/min離心，5 min，去上清，轉(zhuǎn)入35 mm培養(yǎng)皿，37℃，5%CO2，培養(yǎng)，組織塊貼壁過夜，第2天補(bǔ)加1.5 ml 原代細(xì)胞培養(yǎng)液。待細(xì)胞匯合至80%，進(jìn)行傳代。

1.4.2 牙髓干細(xì)胞：取上述刮牙周膜組織牙齒，切開牙冠，暴露牙髓，取出牙髓，浸入3倍雙抗PBS中，后續(xù)操作同上，待細(xì)胞匯合至80%，傳代。

1.4.3 細(xì)胞純化、擴(kuò)增：分別收集培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的牙周膜細(xì)胞與牙髓細(xì)胞上清液，作為適應(yīng)性培養(yǎng)基；對培養(yǎng)細(xì)胞消化、離心、去上清，加適應(yīng)性培養(yǎng)基，吹打，過細(xì)胞篩，制成單個(gè)細(xì)胞超過懸液90%，調(diào)增細(xì)胞密度為每毫升10～15個(gè)，接種與96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h、48 h，標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞孔，補(bǔ)至每孔200 μl，第6天，半量換液，隨后每2天換1次。7～14 d，細(xì)胞數(shù)≥50為出現(xiàn)細(xì)胞克隆，待克隆細(xì)胞至孔底1/2～2/3后，用0.25%胰酶消化，離心，去上清，移至48孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)，至24孔、12孔、6孔，轉(zhuǎn)入6 cm、10 cm培養(yǎng)皿、T25培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞覆蓋瓶底80%，胰酶消化，離心，去上清，轉(zhuǎn)入T75瓶培養(yǎng)，得到第8代干細(xì)胞，制備為單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度超過1×107/ml，備用。

1.5 分析方法

1.5.1 細(xì)胞生長測定：將細(xì)胞懸液調(diào)為密度1×104/ml，接種至96孔板，分為12組，每組6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)1～12 d，每天取1組，棄培養(yǎng)液，每孔加基礎(chǔ)培養(yǎng)基，5%CO2，37℃培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀492 nm處測A值，重復(fù)3次，取平均值，比較同一時(shí)間兩種細(xì)胞OD值。

1.5.2 流式細(xì)胞儀：制備細(xì)胞混懸液，密度為1×106/ml，分別裝入EP管中，標(biāo)記，每組6個(gè)管，加入濃度為0.2 mg/ml的STRO-1、CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD146、CD166對應(yīng)的同型抗體濃度。4℃避光孵育50 min，PBS重懸，離心，棄上清，加PBS重懸，過濾，流式細(xì)胞儀測定分析。

1.5.3 細(xì)胞集落檢測：參考文獻(xiàn)[7]。對數(shù)生長期的細(xì)胞，常規(guī)消化傳代，制作為細(xì)胞懸液，分散細(xì)胞使單給細(xì)胞超過95%，按照每皿5 μl含50、100、200細(xì)胞的濃度，接種至培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2培養(yǎng)，根據(jù)pH值變化更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)3周，棄原液，PBS液洗滌，多聚甲醛固定，PBS洗滌，加甲苯胺藍(lán)染色15 min，PBS洗滌，干燥，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆集落，集落為細(xì)胞數(shù)≥50個(gè)，計(jì)算集落形成率(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長增殖情況比較 牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)3 d出現(xiàn)快速生長，第9天后進(jìn)入平臺(tái)期；牙周膜干細(xì)胞在培養(yǎng)4 d后開始快速生長，第8天就進(jìn)入平臺(tái)期。在3～12 d時(shí)，牙髓干細(xì)胞細(xì)胞增殖A值顯著高于牙周膜干細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

類別1 d2 d3 d4 d5 d6 d牙髓干細(xì)胞 0.23±0.080.26±0.080.50±0.100.69±0.121.02±0.231.41±0.32牙周膜干細(xì)胞0.24±0.080.25±0.070.38±0.110.42±0.120.79±0.211.08±0.30P值>0.05>0.05<0.05<0.05<0.05<0.05類別7 d8 d9 d10 d11 d12 d牙髓干細(xì)胞 1.52±0.411.61±0.441.73±0.481.75±0.511.76±0.501.77±0.51牙周膜干細(xì)胞1.29±0.321.40±0.351.43±0.321.44±0.331.45±0.311.45±0.30P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

2.2 2種細(xì)胞中STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD105、CD34、CD45表達(dá)率比較 牙周膜干細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞中STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD105均呈高表達(dá)。牙周膜干細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞中STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD146、CD105、CD34、CD45表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

類別STRO-1CD44CD29CD90CD34CD45CD73CD146CD105牙周膜干細(xì)胞92.13±13.8190.32±15.5293.0±15.5795.94±16.632.03±0.712.31±0.6897.43±17.4395.53±15.9497.99±14.48牙髓干細(xì)胞 92.05±14.5090.41±14.9692.7±14.9396.10±17.212.25±0.732.20±0.6598.02±18.1596.12±16.2897.62±15.53

2.3 2種細(xì)胞中集落形成率比較 牙髓干細(xì)胞的集落形成率為(4.56±0.88)%顯著高于牙周膜干細(xì)胞的(2.21±0.63)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

類別集落形成率牙周膜干細(xì)胞2.21±0.63牙髓干細(xì)胞 4.56±0.88?

注：與牙周膜干細(xì)胞比較，*P<0.05

3 討論

3.1 牙髓干細(xì)胞與牙周膜干細(xì)胞 干細(xì)胞(stem cells)是一類具有自我更新、自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞[8]。在一定條件下，它可以分化成多種APSC多能細(xì)胞，是一類具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細(xì)胞。多能干細(xì)胞(Ps)具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能，但失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制[9]。

人牙周膜干細(xì)胞是來源牙周膜的成體干細(xì)胞，有較強(qiáng)的更新能力，可進(jìn)一步分化為不同功能特性的細(xì)胞[10,11]。人牙周膜干細(xì)胞可分化為牙槽骨、牙骨質(zhì)、牙周膜，對維持牙周膜穩(wěn)定、修復(fù)牙組織[12,13]。人牙周膜干細(xì)胞有高度的增殖能力以及自我更新的能力，除了可分化為牙骨質(zhì)、牙槽骨、牙周膜外，研究顯示，其還可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、膠原細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、牙骨質(zhì)細(xì)胞[14,15]。人牙周膜干細(xì)胞來源與牙周膜細(xì)胞群，原代培養(yǎng)成本低，操作簡單，一般分離人牙周膜干細(xì)胞有3種方法，包括組織塊法，酶解組織塊法、酶聯(lián)合消化法，本研究應(yīng)用酶解組織塊法。組織塊法培養(yǎng)原代時(shí)間長，酶聯(lián)合消化法酶消化時(shí)間不容易確定，并且與酶解組織塊法比較，原代培養(yǎng)成功率，但是克隆率要高。

牙髓干細(xì)胞無論從數(shù)量上，還是分離培養(yǎng)方法上，要優(yōu)于牙周膜干細(xì)胞，并且其在神經(jīng)方面的分化潛能，使其有成為干細(xì)胞庫的潛能。牙髓屬于結(jié)締組織，有一定的修復(fù)再生能力，牙髓干細(xì)胞體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其具有高度增生能力與自我更新能力。牙髓干細(xì)胞具有與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞相似的免疫表型，并且前者具有更高的增生率。牙髓干細(xì)胞具有形成礦化結(jié)節(jié)能力，形態(tài)為梭形，除了自我更新，還具有多向分化的功能，可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。牙髓干細(xì)胞用于牙周組織在上、牙髓組織再生、頜面部骨組織缺損修復(fù)等具有較好的安全性。并且動(dòng)物模型研究顯示，牙髓干細(xì)胞還可用于軟骨、神經(jīng)、角膜等再生[15]。目前對牙髓干細(xì)胞的研究還處于早期階段，對其應(yīng)用也較為局限，但其在再生醫(yī)學(xué)工程、組織工程方面具有較好的應(yīng)用潛能[16]。

3.2 牙髓干細(xì)胞與牙周膜干細(xì)胞的生長特性 在臨床應(yīng)用中，因牙周膜干細(xì)胞數(shù)量少，培養(yǎng)相對困難，并且來源有限，極大限制其轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，而與之相比，牙髓干細(xì)胞無論從數(shù)量上，還是分離培養(yǎng)方法上，都明顯優(yōu)于牙周膜干細(xì)胞，因此具有成為該細(xì)胞庫的潛能[17,18]。牙髓屬于結(jié)締組織，有一定的修復(fù)再生能力，因成牙本質(zhì)細(xì)胞屬于終末細(xì)胞，一旦分化，就不再分裂，因此，一般認(rèn)為牙本質(zhì)細(xì)胞受損后，牙髓內(nèi)未分化前提細(xì)胞能分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞[19-22]。目前認(rèn)為牙髓干細(xì)胞可能來自血管周圍微環(huán)境[23-25]。本研究結(jié)果也顯示，牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)3 d出現(xiàn)快速生長，在第9天后進(jìn)入平臺(tái)期；牙周膜干細(xì)胞在培養(yǎng)4 d后開始快速生長，在第8天就進(jìn)入平臺(tái)期。2組在3～12 d時(shí)，牙髓干細(xì)胞細(xì)胞增殖A值顯著高于牙周膜干細(xì)胞。提示牙髓干細(xì)胞的增殖速度要快于牙周膜細(xì)胞，并且增殖時(shí)間更長。通常認(rèn)為消化酶法獲得的牙髓干細(xì)胞具有更高的細(xì)胞增值率，成骨分化能力，成牙本質(zhì)分化能力，但組織塊法獲得的牙髓干細(xì)胞具有形態(tài)更均勻的優(yōu)勢。氧濃度對維持干細(xì)胞可塑性、以及增殖能力發(fā)揮重要作用。環(huán)境氧濃度可損傷間充質(zhì)干細(xì)胞的DNA，導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定型，而低氧濃度有利于維持干細(xì)胞的微環(huán)境，增加其安全性。一般認(rèn)為在5%的氧濃度時(shí)，牙髓干細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖潛能。

3.3 牙髓干細(xì)胞與牙周膜干細(xì)胞表型 CD34、CD45是造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物，本研究顯示，在牙髓干細(xì)胞與牙周膜干細(xì)胞中，兩者均呈低表達(dá)。CD29屬于黏附因子表型，在干細(xì)胞高表達(dá)。STRO-1是一種IgM單克隆抗體，主要存在于骨髓，是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志。本研究中，人牙周膜干細(xì)胞與人牙髓干細(xì)胞均呈高表達(dá)。CD44、CD73、CD90、CD105、CD146、CD166是干細(xì)胞具有典型性的標(biāo)志物，其中CD44是間充質(zhì)細(xì)胞未分化細(xì)胞標(biāo)志。CD73表達(dá)于間充質(zhì)干細(xì)胞，可促進(jìn)干細(xì)胞增殖，抑制干細(xì)胞衰老，CD90可促進(jìn)干細(xì)胞快速增殖。表達(dá)與滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的CD105可促使其分化為成軟骨的能力。本研究中，人牙周膜干細(xì)胞與人牙髓干細(xì)胞均呈高表達(dá)，提示兩種細(xì)胞均具有干細(xì)胞特征。牙髓干細(xì)胞表達(dá)多種干細(xì)胞標(biāo)志物，也證實(shí)其多相分化的可能性。延髓干細(xì)胞在體外培養(yǎng)，可礦化為礦化結(jié)節(jié)，其還可以分化為脂肪細(xì)胞。有研究顯示，牙髓干細(xì)胞在mRNA水平與蛋白水平表達(dá)神經(jīng)前提細(xì)胞標(biāo)志以及膠原細(xì)胞標(biāo)志，其還能產(chǎn)生多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，提示其具有分化為神經(jīng)細(xì)胞的潛能[23]。

綜上所述，牙髓干細(xì)胞增殖速度較牙周膜細(xì)胞增殖更快，在牙髓組織修復(fù)、牙齒組織工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。