含二苯醚結(jié)構(gòu)單元的新型煙酰胺類(lèi)衍生物的合成及殺菌活性研究

李 華，武 園，高夢(mèng)琪，朱曉磊，楊光富

（華中師范大學(xué)農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079）

琥珀酸脫氫酶（SDH）作為一類(lèi)重要的殺菌劑靶標(biāo)，在農(nóng)藥學(xué)研究領(lǐng)域扮演著十分重要的角色。琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHI）類(lèi)殺菌劑因其具有高效、廣譜的殺菌活性和環(huán)境友好的特點(diǎn)，成為殺菌劑市場(chǎng)的“黑馬”，受到世界各大農(nóng)藥公司的關(guān)注[1]。啶酰菌胺（boscalid）為巴斯夫公司開(kāi)發(fā)的煙酰胺類(lèi)殺菌劑，是第一個(gè)廣譜性的SDHI類(lèi)殺菌劑，幾乎對(duì)所有的真菌病害都有效果，主要用于防治白粉病、灰霉病、菌核病、各類(lèi)腐爛病、褐腐病和根腐病等[2]。啶酰菌胺是在滅銹胺和氟酰胺的基礎(chǔ)上，利用生物電子等排原理，將酸部分的苯環(huán)替換為吡啶環(huán)，同時(shí)將胺部分的苯環(huán)替換為空間位阻更大的聯(lián)苯結(jié)構(gòu)而得到高活性、低毒性、高內(nèi)吸性和高選擇性的化合物。啶酰菌胺與多菌靈、腐霉利等無(wú)交互抗性，對(duì)作物安全，加上有利的生態(tài)效果和毒理學(xué)數(shù)據(jù)，使之迅速成為上億美元的產(chǎn)品[3]。其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 啶酰菌胺的結(jié)構(gòu)式

近年來(lái)，一些結(jié)構(gòu)類(lèi)似的品種不斷涌現(xiàn)，如氟唑菌酰胺（fluxapyroxad）、聯(lián)苯吡菌胺（bixafen）和pyraziflumid等（圖2）。這些化合物的顯著特點(diǎn)為：酸部分不再局限于吡啶環(huán)，出現(xiàn)了吡唑環(huán)和吡嗪環(huán)；酰胺鍵旁邊碳上的取代基由氯原子變成了二氟甲基或三氟甲基，活性有了進(jìn)一步提高[4-6]。但這些化合物的胺部分仍為聯(lián)苯結(jié)構(gòu)，需要昂貴的鈀催化劑和苯硼酸作為原料，成本較高[7]。

圖2 近年來(lái)上市的聯(lián)苯類(lèi)SDHIs的結(jié)構(gòu)式

在課題組前期的工作中，筆者發(fā)現(xiàn)柔性的二苯醚片段替換剛性的聯(lián)苯片段，可以有效地降低合成成本，提高生物活性，并且成功開(kāi)發(fā)了候選殺菌劑品種氯苯醚酰胺和氟苯醚酰胺[8]。因此，本文在啶酰菌胺的基礎(chǔ)上，將其胺部分的聯(lián)苯替換為二苯醚，酰胺鍵旁邊碳上的取代基由氯原子替換為三氟甲基，繼而合成了一系列含二苯醚結(jié)構(gòu)單元的新型煙酰胺類(lèi)化合物。目標(biāo)化合物的合成路線見(jiàn)圖3。在本研究中，以廉價(jià)的取代苯酚和鄰氟硝基苯為起始原料，通過(guò)芳環(huán)上的親核取代反應(yīng)和還原反應(yīng)得到氨基二苯醚，其再與2-三氟甲基煙酸經(jīng)EDCI/HOBt?；玫?2個(gè)未見(jiàn)報(bào)道的煙酰胺類(lèi)化合物。隨后，對(duì)所合成的目標(biāo)化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定、離體酶抑制活性測(cè)試、作用模式研究、構(gòu)效關(guān)系和活體殺菌活性研究，旨在發(fā)現(xiàn)較高活性的新化合物。

圖3 目標(biāo)化合物的合成路線

1 材料與方法

1.1 所用儀器及試劑

使用儀器及試劑：循環(huán)水式真空泵，型號(hào)為SHZ-D（Ⅲ）；遠(yuǎn)紅外線干燥箱，型號(hào)為W70-1；電子天平，型號(hào)為德國(guó)Sartotuis BSA223S-CW；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，型號(hào)為BüCHI R-200；隔膜泵，型號(hào)為BuCHI Vacuum Pump=V-700；低溫循環(huán)冷卻泵，型號(hào)為DLSB；恒溫磁力攪拌器，型號(hào)為德國(guó)Heidolph MR3001。使用60～90℃沸程的石油醚；其他溶劑和試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均從各大試劑公司購(gòu)買(mǎi)，為分析純或化學(xué)純。

化合物結(jié)構(gòu)鑒定與表征使用儀器：核磁共振儀，型號(hào)為Varian VNMR 400 MHz（溶劑為DMSO-d6，內(nèi)標(biāo)為T(mén)MS）；數(shù)字熔點(diǎn)儀（溫度計(jì)未經(jīng)校正），型號(hào)為BüCHI B-545；高分辨質(zhì)譜儀，型號(hào)為WATERS MALDI SYNAPT G2 HDMS（MA，USA）。

1.2 關(guān)鍵中間體的合成

1.2.1 中間體M-1的合成

在100 mL圓底燒瓶中加入5 mmol 2-氟硝基苯、6 mmol取代苯酚和7.5 mmol碳酸鉀，再加入20 mL DMF后升溫至100℃。TLC監(jiān)測(cè)原料反應(yīng)完全后停止反應(yīng)，加入50 mL乙酸乙酯后用30 mL 2 mol NaOH洗2次，再用50 mL飽和食鹽水洗1次，減壓除去溶劑后得中間體M-1。

1.2.2 中間體M-2的合成

在100 mL圓底燒瓶中加入3 mmol中間體M-1和3.6 mmol氯化銨，再加入50 mL乙醇和5 mL水，加熱至回流后加入還原鐵粉（9 mmol），TLC監(jiān)測(cè)原料反應(yīng)完畢后停止反應(yīng)，硅藻土過(guò)濾，濾液旋去大部分溶劑后加入50 mL乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用50 mL飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑后柱層析得中間體M-2。

將3 mmol取代的1-氟-4-三氟甲苯、3.6 mmol 2-氨基苯酚和4.5 mmol碳酸鉀加入到50 mL圓底燒瓶中，再加入20 mL DMF，升溫至70℃，TLC監(jiān)測(cè)原料反應(yīng)完畢后停止反應(yīng)，加入50 mL乙酸乙酯，分別用50 mL飽和食鹽水洗2次后加無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓除去溶劑后柱層析得中間體M-2。

1.3 目標(biāo)化合物的合成及表征

在100 mL圓底燒瓶中加入2-(三氟甲基)煙酸（2 mmol）、EDCI（0.460 g，2.4 mmol）、HOBt（0.325 g，2.4 mmol）和10 mL DMF，室溫下反應(yīng)1 h，然后將中間體M-2（2.4 mmol）加入到上述溶液，室溫下反應(yīng)24 h,減壓除去溶劑后柱層析得目標(biāo)化合物TM（圖4、表1）。

圖4 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)式

表1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)

化合物TM-1為白色粉末，收率為85%，熔點(diǎn)為112.6～113.3℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.49（s，1H）、8.82（d，J=4.5 Hz，1H）、8.00（dd，J=10.3、5.9 Hz，2H）、7.79（dd，J=7.8、4.7 Hz，1H）、7.47-7.32（m，1H）、7.27-7.15（m，4H）、7.13-7.02（m，1H）、6.86（dd，J=6.2、3.3 Hz，1H）。HRMS（MALDI）Calcd for C19H12F4N2O2[M＋H]＋：377.090 77，found 377.090 19。

化合物TM-2為白色粉末，收率為75%，熔點(diǎn)為109.0～110.1℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.49（s，1H）、8.82（d，J=4.5 Hz，1H）、8.00（dd，J=10.3、6.0 Hz，2H）、7.79（dd，J=7.8、4.8 Hz，1H），7.46-7.33（m，1H）、7.27-7.14（m，4H）、7.13-7.02（m，1H）、6.91-6.80（m，1H）。HRMS（MALDI）Calcd for C19H12ClF3N2O2[M＋Na]＋：415.043 16，found 415.045 00。

化合物TM-3為白色粉末，收率為83%，熔點(diǎn)為126.5～127.6℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.46（s，1H）、8.82（d，J=4.4 Hz，1H）、7.99 （dd，J=8.4、5.2 Hz，2H）、7.80（dd，J=7.8、4.8 Hz，1H）、7.74（dd，J=8.0、1.4 Hz，1H）、7.47-7.34（m，1H）、7.26-7.16（m，2H）、7.16-7.10（m，1H）、7.01（dd，J=8.2、1.1 Hz，1H）、6.85-6.72（m，1H）。HRMS（MALDI）Calcd for C19H12BrF3N2O2[M＋H]＋：437.010 70，found 437.011 48。

化合物TM-4為白色粉末，收率為81%，熔點(diǎn)為87.2～88.1℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.39（s，1H）、8.82（d，J=4.5 Hz，1H）、8.01-7.91（m，2H）、7.79（dd，J=7.8、4.7 Hz，1H）、7.32（d，J=7.2 Hz，1H）、7.21（t，J=7.1 Hz，1H）、7.17-7.07（m，3H）、6.86（d，J=7.9 Hz，1H）、6.74-6.66（m，1H）、2.18（s，3H）。HRMS（MALDI）Calcd for C20H15F3N2O2[M＋Na]＋：395.097 78，found 395.097 39。

化合物TM-5為白色粉末，收率為89%，熔點(diǎn)為127.0～128.1℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.43（s，1H）、8.82（d，J=4.5 Hz，1H）、7.97（d，J=7.7 Hz，1H）、7.92-7.85（m，1H）、7.82（dd，J=7.8、4.7 Hz，1H）、7.77（d，J=7.8 Hz，1H）、7.64（t，J=7.4 Hz，1H）、7.32（d，J=7.6 Hz，1H）、7.28-7.24（m，2H）、6.99（d，J=8.3 Hz，1H）、6.94（dd，J=6.1、3.5 Hz，1H）。HRMS（MALDI）Calcd forC20H12F6N2O2[M＋H]＋：427.087 57，found 427.088 01。

化合物TM-6為白色粉末，收率為95%，熔點(diǎn)為112.2～112.9℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.43（s，1H）、8.81（d，J=3.2 Hz，1H）、7.96（d，J=7.5 Hz，1H）、7.84-7.70（m，2H）、7.49（t，J=8.3 Hz，1H）、7.36-7.25（m，2H）、7.12（dd，J=7.5、1.8 Hz，2H）、6.98-6.87（m，2H）。 HRMS（MALDI） Calcd for C20H12F6N2O3[M＋H]＋：443.082 49，found 443.081 49。

化合物TM-7為白色粉末，收率為78%，熔點(diǎn)為87.5～88.2℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.41（s，1H）、8.81（d，J=3.7 Hz，1H）、7.95（dd，J=6.3、3.2 Hz，1H）、7.78（dt，J=7.8、5.7 Hz，2H）、7.40（t，J=8.2 Hz，1H）、7.32-7.23（m，2H）、7.19（dd，J=8.0、1.2 Hz，1H）、7.12-7.06（m，1H）、6.99（t，J=2.0 Hz，1H）、6.92（dd，J=8.3、2.1 Hz，1H）。HRMS（MALDI）Calcd for C19H12ClF3N2O2[M＋H]＋：393.061 22，found 393.061 47。

化合物TM-8為白色粉末，收率為75%，熔點(diǎn)為122.8～123.9℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.42（s，1H）、8.81（d，J=4.5 Hz，1H）、8.02-7.94（m，1H）、7.91（d，J=7.7 Hz，1H）、7.78（dd，J=7.8、4.7 Hz，1H）、7.28-7.22（m，4H）、7.08-6.98（m，2H）、6.97-6.89（m，1H）。HRMS（MALDI） Calcd for C19H12F4N2O2[M＋Na]＋：399.072 71，found 399.072 03。

化合物TM-9為白色粉末，收率為83%，熔點(diǎn)為119.5～120.6℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.41（s，1H）、8.81（d，J=4.3 Hz，1H）、8.05-7.90（m，1H）、7.86（d，J=7.5 Hz，1H）、7.77（dd，J=7.7、4.7 Hz，1H）、7.43（d，J=8.8 Hz，2H）、7.31-7.18（m，2H）、7.07-6.89（m，3H）。HRMS（MALDI） Calcd for C19H12ClF3N2O2[M＋H]＋：393.061 22，found 393.060 87。

化合物TM-10為白色粉末，收率為82%，熔點(diǎn)為113.5～114.5℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.40（s，1H）、8.82-8.78（m，1H）、7.99-7.91（m，1H）、7.78-7.69（m，4H）、7.37-7.27（m，2H）、7.21-7.14（m，1H）、7.09（d，J=8.6 Hz，2H）。HRMS（MALDI）Calcd for C20H12F6N2O2[M＋H]＋：427.087 57，found 427.087 30。

化合物TM-11為白色粉末，收率為84%，熔點(diǎn)為109.0～109.9℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.50（s，1H）、8.82（d，J=4.5 Hz，1H）、8.00（t，J=7.5 Hz，2H）、7.80（dd，J=7.8、4.7 Hz，1H）、7.33-7.13（m，4H）、7.03（dd，J=7.6、1.7 Hz，1H）、6.83（t，J=7.6 Hz，1H）。HRMS（MALDI）Calcd for C19H11F5N2O2[M＋H]＋：395.081 35，found 395.080 77。

化合物TM-12為白色粉末，收率為80%，熔點(diǎn)為112.9～113.5℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.41（s，1H）、8.82（d，J=4.2 Hz，1H）、8.00（d，J=7.6 Hz，1H）、7.87（dd，J=7.6、1.7 Hz，1H）、7.80（dd，J=7.8、4.8 Hz，1H）、7.37（d，J=2.3 Hz，1H）、7.24-7.10（m，3H）、6.74（dd，J=7.8、1.3 Hz，1H）、6.68（d，J=8.5 Hz，1H）、1.37（s，9H）、1.27（s，9H）。HRMS（MALDI）Calcd for C27H29F3N2O2[M＋H]＋：471.225 39，found 471.224 49。

化合物TM-13為白色粉末，收率為85%，熔點(diǎn)為111.0～112.3℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.45（s，1H）、8.82（d，J=4.5 Hz，1H）、8.00（d，J=2.0 Hz，1H）、7.98-7.91（m，2H）、7.80（dd，J=7.8、4.8 Hz，1H）、7.69（dd，J=8.7、1.9 Hz，1H）、7.38-7.25（m，2H）、7.10（dd，J=7.7、1.7 Hz，1H）、7.03（d，J=8.6 Hz，1H）。HRMS （MALDI） Calcd for C20H11ClF6N2O2[M＋H]＋：461.048 60，found 461.048 77。

化合物TM-14為白色粉末，收率為82%，熔點(diǎn)為119.5～120.7℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.44（s，1H）、8.82（d，J=4.6 Hz，1H）、8.11（d，J=1.9 Hz，1H）、7.98-7.89（m，2H）、7.80（dd，J=7.8、4.8 Hz，1H）、7.73（dd，J=8.7、2.0 Hz，1H）、7.34-7.31（m，2H）、7.08（dd，J=7.7、1.8 Hz，1H）、7.00（d，J=8.6 Hz，1H）。HRMS（MALDI）Calcd forC20H11BrF6N2O2[M＋H]＋：504.998 09，found 504.997 21。

化合物TM-15為白色粉末，收率為81%，熔點(diǎn)為124.5～125.1℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.42（s，1H）、8.82（d，J=4.6 Hz，1H）、8.21（d，J=1.8 Hz，1H）、7.97（d，J=7.8 Hz，1H）、7.92（dd，J=7.6、2.0 Hz，1H）、7.80（dd，J=7.8、4.7 Hz，1H）、7.73（dd，J=8.7、1.9 Hz，1H）、7.36-7.22（m，2H）、7.02（dd，J=7.7、1.8 Hz，1H）、6.92（d，J=8.6 Hz，1H）。HRMS（MALDI）Calcd for C20H11F6IN2O2[M＋H]＋：552.984 22，found 552.984 07。

化合物TM-16為白色粉末，收率為85%，熔點(diǎn)為152.8～153.4℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.47（s，1H）、8.85（d，J=4.4 Hz，1H）、8.09（s，1H）、8.02（dd，J=16.3、8.3 Hz，2H）、7.89-7.83（m，2H）、7.44-7.34（m，2H）、7.21（d，J=7.4 Hz，1H）、7.15（d，J=8.8 Hz，1H）。HRMS（MALDI） Calcd for C21H11F9N2O2[M＋H]＋：495.074 96，found 495.074 18。

化合物TM-17為白色粉末，收率為89%，熔點(diǎn)為73.4～74.1℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.37（s，1H）、8.81（d，J=4.5 Hz，1H）、8.01-7.94（m，1H）、7.89（d，J=7.7 Hz，1H）、7.78（dd，J=7.8、4.8 Hz，1H）、7.22（d，J=7.8 Hz，1H）、7.18-7.09（m，2H）、6.99（d，J=7.7 Hz，1H）、6.74（s，1H）、6.67（dd，J=7.3、2.1 Hz，1H）、2.87-2.74（m，1H）、2.12（s，3H）、1.12（d，J=6.9 Hz，6H）。HRMS（MALDI）Calcd for C23H21F3N2O2[M＋H]＋：415.162 79，found 415.163 37。

化合物TM-18為白色粉末，收率為73%，熔點(diǎn)為85.8～87.1℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.39（s，1H）、8.82（d，J=4.5 Hz，1H）、8.04-7.89（m，2H）、7.80（dd，J=7.8、4.7 Hz，1H）、7.27（d，J=7.9 Hz，1H）、7.13（pd，J=7.4、1.7 Hz，2H）、6.98（d，J=7.7 Hz，1H）、6.73-6.63（m，2H）、3.18（dt，J=13.8、6.9 Hz，1H）、2.56-2.47（m，1H）、1.14（d，J=6.9 Hz，6H）。 HRMS（MALDI）Calcd for C23H21F3N2O2[M＋H]＋：415.162 79，found 415.162 46。

化合物TM-19為白色粉末，收率為75%，熔點(diǎn)為99.1～100.3℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.46（s，1H）、8.83（d，J=4.6 Hz，1H）、8.09-7.95（m，2H）、7.89-7.79（m，2H）、7.67（d，J=8.2 Hz，1H）、7.43-7.28（m，2H）、7.18（s，1H）、7.12（dd，J=7.6、1.9 Hz，1H）。HRMS（MALDI）Calcd for C21H11F9N2O2[M＋H]＋：495.074 96，found 495.074 00。

化合物TM-20為白色粉末，收率為90%，熔點(diǎn)為162.3～163.2℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.35（s，1H）、8.80（d，J=2.8 Hz，1H）、8.02-7.88（m，1H）、7.86-7.72（m，2H）、7.27-7.13（m，2H）、7.03-6.90（m，1H）、6.78（s，1H）、6.60（s，2H）、2.23（s，6H）。HRMS（MALDI）Calcd for C21H17F3N2O2[M＋Na]＋：409.113 43，found 409.113 81。

化合物TM-21為白色粉末，收率為82%，熔點(diǎn)為142.9～143.4℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.44（s，1H）、8.81（d，J=4.0 Hz，1H）、7.99（dd，J=7.7、1.8 Hz，1H）、7.92-7.87（m，1H）、7.84（s，1H）、7.78（dd，J=7.8、4.7 Hz，1H）、7.50（s，2H）、7.44-7.32（m，2H）、7.27（dd，J=7.8、1.7 Hz，1H）。HRMS（MALDI）Calcd for C21H11F9N2O2[M＋H]＋：495.074 96，found 495.075 33。

化合物TM-22為白色粉末，收率為79%，熔點(diǎn)為103.9～104.7℃。

1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：10.42（s，1H）、8.83（d，J=4.4 Hz，1H）、8.06-7.90（m，2H）、7.81（dd，J=7.8、4.7 Hz，1H）、7.39-7.24（m，2H）、7.14（dd，J=7.5、2.0 Hz，1H）、6.94（dd，J=9.1、6.0 Hz，2H）。HRMS（MALDI）Calcd for C19H10F6N2O2[M＋H]＋：413.071 92，found 413.410 12。

1.4 離體酶抑制活性測(cè)定

按文獻(xiàn)[9]中的方法對(duì)合成的22個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行離體酶水平的活性測(cè)試。測(cè)試中使用的SDH來(lái)自豬心線粒體。反應(yīng)底物為琥珀酸和2,6-二氯酚吲哚酚鈉（2,6-dichlorophenolindophenol,DCIP）。琥珀酸被氧化成延胡索酸，被還原后的泛醌繼續(xù)將電子傳遞給電子受體DCIP，最終DCIP被還原并產(chǎn)生光吸收變化。反應(yīng)總體積為200 μL，其中含pH=7.4的100 mmol/L磷酸緩沖液、20 mmol/L琥珀酸、53 μmol/L DCIP、0.3 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）和20.6 nmol/L酶，在30℃恒溫條件下反應(yīng)，監(jiān)測(cè)7 min內(nèi)波長(zhǎng)為600 nm處底物DCIP的還原產(chǎn)物的光吸收變化。根據(jù)DCIP的摩爾消光系數(shù)21 mmol/(L·cm)，可以計(jì)算得到DCIP的還原產(chǎn)量，并用origin軟件擬合得到反應(yīng)初速度。加入不同抑制劑時(shí)反應(yīng)速率不同，按照公式計(jì)算抑制率，并用Sigmaplot軟件擬合求出IC50值。

1.5 分子對(duì)接

小分子的三維結(jié)構(gòu)通過(guò)SYBYL-X 2.0構(gòu)建，使用最陡下降法和共軛梯度法各2 000步優(yōu)化結(jié)構(gòu)，收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.001 kcal/(mol·?)。受體選用豬心SDH，其晶體結(jié)構(gòu)可從PDB庫(kù)中獲?。≒DB ID：1ZOY）。由于其活性腔只涉及B、C、D三條鏈，且距離A鏈較遠(yuǎn)，所以對(duì)接時(shí)將A鏈刪除。對(duì)接時(shí)格點(diǎn)盒子大小設(shè)置為50×44×44，格點(diǎn)間距為0.375 ?。對(duì)接過(guò)程中使用拉馬克遺傳算法搜索構(gòu)象，對(duì)接構(gòu)象個(gè)數(shù)為256。其余參數(shù)均采用默認(rèn)值。對(duì)接結(jié)束后，挑選合適的構(gòu)象進(jìn)行簡(jiǎn)單優(yōu)化并計(jì)算結(jié)合能，挑選結(jié)合能最優(yōu)的構(gòu)象確定其結(jié)合模式[10]。

1.6 溫室盆栽試驗(yàn)

委托沈陽(yáng)化工研究院對(duì)22個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行活體水平的殺菌活性測(cè)試，具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]殺菌劑卷中SOP-SC-1101黃瓜白粉病盆栽法、SOP-SC-1119玉米銹病盆栽法和SOP-SC-1120大豆銹病盆栽法。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體酶抑制活性

目標(biāo)化合物對(duì)豬心來(lái)源SDH的抑制活性測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，10個(gè)化合物的IC50值達(dá)到了微摩爾水平，優(yōu)于對(duì)照藥劑啶酰菌胺，其中化合物TM-12、TM-15、TM-18的IC50值分別為0.24、0.23、0.20 μmol/L，較啶酰菌胺（IC50=2.57 μmol/L）提高了近10倍。總結(jié)構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)：①對(duì)于單取代化合物，2號(hào)位取代最優(yōu)，對(duì)于2號(hào)位取代的化合物活性，2-CF3＞2-Br＞2-Cl＞2-F，說(shuō)明2號(hào)位的位阻越大，越有利于活性的提高；②對(duì)于雙取代化合物，2,3-二取代、2,4-二取代和2,5-二取代活性普遍較高，只有3,5-二取代的化合物的活性較差，在10 μmol/L的濃度下抑制率小于50%，進(jìn)一步說(shuō)明了2號(hào)位對(duì)活性的保持至關(guān)重要。

2.2 作用模式研究

為了研究目標(biāo)化合物與靶標(biāo)蛋白的作用模式，將酶抑制活性較好的代表化合物TM-18和啶酰菌胺分別與豬心來(lái)源SDH進(jìn)行了分子對(duì)接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺的酰胺氧原子與B_W173殘基和D_Y91殘基形成兩個(gè)氫鍵（圖5（A））；吡啶環(huán)與C_R46殘基形成π-cation相互作用；聯(lián)苯的中間苯環(huán)處于C_I30、C_W35、C_I43和B_W172殘基形成的疏水口袋中。代表化合物TM-18的結(jié)合模式（圖5（B））與啶酰菌胺類(lèi)似，其酰胺氧原子與B_W173殘基和D_Y91殘基形成兩個(gè)氫鍵；吡啶環(huán)與C_R46殘基形成π-cation相互作用；二苯醚的中間苯環(huán)部分同樣處于SDH的疏水口袋中。此外，化合物TM-18二苯醚的末端苯環(huán)與D_Y91殘基形成π-π相互作用，與C_I43殘基和B_W173殘基形成疏水相互作用，以上作用使得化合物TM-18與SDH結(jié)合時(shí)有較強(qiáng)的范德華力，如表3所示，其ΔEvdw為-48.41 kcal/mol，絕對(duì)值大于啶酰菌胺與SDH的ΔEvdw（-40.76 kcal/mol）絕對(duì)值。

表2 目標(biāo)化合物對(duì)豬心來(lái)源SDH的抑制活性

圖5 啶酰菌胺和化合物TM-18與豬心來(lái)源SDH的結(jié)合模式及TM-18和啶酰菌胺的疊合圖

表3 代表化合物TM-18和啶酰菌胺與豬心來(lái)源SDH的計(jì)算結(jié)合自由能 kcal/mol

2.3 溫室盆栽殺菌活性

目標(biāo)化合物對(duì)黃瓜白粉病、玉米銹病和大豆銹病的殺菌活性測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，目標(biāo)化合物TM-5、TM-13、TM-14、TM-15、TM-16和TM-19表現(xiàn)出廣譜的殺菌活性，在6.25 mg/L下對(duì)黃瓜白粉病、玉米銹病和大豆銹病防效優(yōu)異，優(yōu)于對(duì)照藥劑啶酰菌胺。進(jìn)一步EC90值測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表5。化合物TM-16對(duì)黃瓜白粉病的治療效果EC90值為28.74 mg/L，較苯醚甲環(huán)唑（108.15 mg/L）提高了近3倍。

3 結(jié) 論

本文以啶酰菌胺為先導(dǎo)化合物，設(shè)計(jì)合成了一類(lèi)含二苯醚結(jié)構(gòu)單元的靶向SDH的新型煙酰胺類(lèi)化合物。酶抑制活性測(cè)試結(jié)果顯示，10個(gè)化合物對(duì)豬心來(lái)源SDH的IC50值均達(dá)到了微摩爾水平，其中化合物TM-12、TM-15、TM-18的IC50值分別為0.24、0.23、0.20 μmol/L，較啶酰菌胺提高了近10倍。通過(guò)分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，新化合物在保留啶酰菌胺酸部分和酰胺鍵與SDH之間關(guān)鍵作用的同時(shí)，二苯醚的末端苯環(huán)還與氨基酸殘基形成了π-π相互作用和疏水相互作用，這可能是新化合物活性較好的原因。

表4 目標(biāo)化合物的溫室盆栽殺菌活性篩選結(jié)果

表5 目標(biāo)化合物TM-16的深入殺菌活性篩選

構(gòu)效關(guān)系研究表明，二苯醚末端苯環(huán)2號(hào)位的取代基對(duì)活性的保持至關(guān)重要，且2號(hào)位上位阻較大的取代有利于活性的提高。進(jìn)一步溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，化合物TM-5、TM-13、TM-14、TM-15、TM-16和TM-19表現(xiàn)出廣譜的殺菌活性，在6.25 mg/L質(zhì)量濃度下對(duì)黃瓜白粉病、玉米銹病和大豆銹病具有優(yōu)異的防效，優(yōu)于對(duì)照藥劑啶酰菌胺。其中化合物TM-16對(duì)黃瓜白粉病的治療效果EC90值為28.74 mg/L，明顯高于苯醚甲環(huán)唑，具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。本研究為新型煙酰胺類(lèi)化合物的設(shè)計(jì)與構(gòu)效關(guān)系研究提供了新思路。